质谱定量的原则内标的选择
LC-MS 2009-11-01 19:44:11 阅读178 评论2 字号：大中小订阅
<3>质谱定量的原则04——系列讲座
内标
在做MS定量时应该使用内标。

选择一个合适的内标，将能减少因为样品提取、HPLC进样和离子化的多样性造成的差异。

在复杂基质的分析中，在SRM积分图上，在标准曲线的低端，常会见到：两个不同的浓度水平，会给出近乎一致的响应。

只有当使用一种内标时，这两个点才能被区分。

一些研究者试图在实验中不用内标去做标准曲线，但成功率不高。

我们在标准曲线上每个浓度水平都重复进样3次。

没有内标的情况下，重现性％RSD常常会高于20%；而当使用内标时，%RSD能降
低到近2%。

我要如何选择一个内标?
最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。

同位素标记的内标将和待测物有相似的回收率、ESI离子化响应，和相似的色谱保留时间。

如果你运行的不是临床药代动力学定量，可能很难判断上述说法，因为特殊的合成一个同位素标记的内标，是非常昂贵和耗时的。

通常，如果你和一个医学的化学家工作，他们会有一个化合物相似物库，可以被用作内标。

这些类似物，在化合物合成中被测试，和该化合物性质相似可以被用户定量内标，而且更重要的是，这些类似物和该化
合物的母离子质量有微小的差异。

尽量不要使用去甲基化（－14）或者是氧化的（＋16）的类似物作内标，因为待测化合物的母离子常会发生同样的代谢。

常见的做内标的类似物是氯代的化合物。

氯代的化合物类似物会和待测化合物有相似的色谱保留时间，这是内标的一个重要特性。

我们已经发现内标物的一个最重要的特性是它和待测化合物共流出。

我该如何使用内标？
首先，内标添加需在样品测试方法的开始阶段，典型的，应在血浆crash 或固相萃取之前。

内标应用同一浓度水平添加（包括标样）。

内标应给出可靠的质谱响应。

应该注意的是：内标的量应添加得合适，应高于定量限，但不能过高，因为过高的内标响应会抑制被分析物的离子化。

“我应该添加多少量的内标？”这是一个重要的问题。

通过做一些试分析：早、中、晚的时间点，也许一个或两个标准点，你应该知道你的样品中化合物的大概量。

这些信息非常有价值，可以帮助建立一个合适的标准曲线，并知道应添加多少量的内标。

举例来说：如果待定量的样品浓度范围是100 fg ～25 pg，检测限是100 fg，你应该添加5～10 pg的内标。

一个好的经验法则是：内标物的量大概是标准工作曲线浓度最高点的1/3。

这将给出一个比较不错的响应，并且不会抑制和干扰待测样品
的离子化。

见图1
内标.gif
图1 内标的量
大规模质谱法简介
目前，研究人员们正在通过各种方法使大规模质谱法变得更有效，而且将这一技术工具缩小化。

大规模质谱法对于药物的发现来说是一个无法比拟的有力工具，而且它在定性与定量分析的应用中有着很大的价值。

虽然大规模质谱法的应用能力和敏感性被不断的改进，但是在药物发现研究里面的技术改革只是出现在专门的工具和应用中。

这一技术工具的发展有着三大趋势：减少样品处理与准备工作，辅以数据分析，促进可携带性和多功能性。

样品处理
样品处理和准备是质谱技术分析中最耗体力的步骤。

通常，要获得一个足够纯度的样品需要两个或更多的分离步骤。

市场上的许多仪器通过整合一个化学分离步骤来减少这些劳动量。

市场上最新的能大幅减轻劳动量的技术是由日本Shimadzu 公司的科学家改进的，这一技术通过机械化样品处理和化学喷墨打印机，被用于直接分析Western blot 实验中的蛋白。

Shimadzu 科学家用化学打印法在Western blot薄膜上点上胰岛素来消化蛋白质，然后应用基质溶液和基质辅助激光解吸离子化快速质谱技术（MALDI-TOF）对膜上的样品进行直接质谱分析。

通过以上分析，研究员能够从一次免疫印迹实验中的任意多个点得到蛋白质质谱印记，PMF数据，或整个蛋白质情况。

Shimadzu 科学家约瑟夫.福克斯博士说：“你能通过一个blot分析做很多事情。

可以想像得到，这一技术不仅使药物或小分子化合物的找寻工作得以很好的进行，并且对于生物标记或蛋白质的找寻工作也有同样的作用。

”Shimadzu 说这一方法的优势在于对于一个
蛋白质，其质量的数据能从它最初被识别的blot中提取,并非跑一块新胶切下条带用于质谱分析。

探索一块凝胶上的大量难懂的条带需要花费几个月的时间，而这项技术通过从Western blot中提取PMF数据可以节省时间并且排除人为错误。

自动化、机械化和最小的样品处理也是Shimadzu 的新器具
LCMS-IT-TOF的主要特点。

这一仪器在离子喷入TOF 室前通过一个四级杆离子陷阱探测器聚焦于离子，因此有着极高的敏感性。

LC/MS能与一个自动取样器一起进行流水化工作。

Shimadzu 的HPLC产品经理Chris Campbell说：“在把样品放在质谱仪器里之前，人们总是希望尽可能少对样品做处理。

样品自动清理是许多质谱仪器使用者梦寐以求的事情。

”
软件分析
第二个快速革新的领域是质谱技术的软件包。

在过去几年中，质谱技术器具敏感性和生产量都得到提高，使得人工数据分析的劳动强度越来越大。

生物系统的应用促进了新的敏感型的四级杆飞行时间Qstar Elite LC/MS/MS TOF 质谱仪上市。

依照公司、软件特征与器具联合使工作流程流线化，而且能更理性的收集数据。

以代谢物表面构型确定为目标的Qstar，据报道能够以最快每秒七个前体离子的速度获得完全扫描的质谱数据。

它的独立数据获得软件的特色是一个专有的算法，这个算法叫做动态背景减少算法（DBS）,该算法能够使质谱仪为收集数据而选择离子时变得“更聪明”。

这个算法收集了20个调查扫描而且分析了那些扫描中出现的所有离子。

与一条相对于时间的强烈的衰退线对比，以最大速度上升的离子能够被选取作为MS/MS数据的收集。

第二个数据管理技术叫做质量差引发独立数据获得技术（MDT IDA）。

这一技术通过对比前体化合物与代谢产物在代谢物表面结构确定中的质量差，进一步减少用于MS/MS数据获得的可选化合物数量。

快捷便利
奥地利的Biocrates 生命科学公司已经开发了一个平台，可以用来从液体样品（如尿液，血浆，或是细胞培养液）中一次性识别并定量1,000多种代谢物。

Biocrates称，这种工具已经超越了采用美国应用生物系统公司的设备提供的数据过滤工具，能够一次性对整个代谢过程进行全面分析。

Biocrates公司首席执行官Armin Graber表示，采用最前沿的自动化样品预处理工具，公司已经为一些疾病地区快速直接的代谢组学分析创立了方法。

根据Graber所说，这间只有15名职员的公司一天能做500个样品。

他还说：“我们已经选择好了代谢产物,我们预先知道该使用哪些设备，哪一个生化途径起了作用，哪些疾病是相关的。

我们预先注释了我们所有的代谢信息。

”
Graber说：“蛋白质的一大优势是体内有很多不同的修饰变体。

因此即使你试着分析识别他们，如果这其中有一个蛋白质的丰度比起其它来说高了极多，解释起来就比较困难。

在代谢中，这类蛋白是一种从功能上讲的代谢终点。

如果代谢产物浓度很高,只能说明它浓度是高的。

如果它是反应的终点,你应该知道反应出了问题。

这就需要对此做一个更直接的解释。

”如果公司们想制作出超越标准容量的软件包，它们就必须发展自己的信息技术。

“没有人以1,000个代谢产物为目标方式。

其他的公司只以两个代谢产物为目标。

”
Thermo公司于2006年2月推出了一款用于质谱技术的蛋白质组增强版工具。

这些包括了Pulsed-Q Dissociation （PQD），用于解决离子阱中小质量蛋白质切割问题，还包括一个BioWorks 软件包的扩大版本，它整合了通过反应物鉴别蛋白质的方法。

详细叙述了从人类HL-60细胞系的微粒片段中鉴别蛋白质的方法。

实验的目的是找出细胞从非黏着状态到黏着状态的变化特征，以及加入卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）后的状态延伸特征。

David K. Han博士等人在实验中，将同位素标记的亲和标签（iCAT）与蛋白质共价相连，使用SEQUEST 数据分析工具，用自动串联质谱仪分析得出结果。

该作者说：“这代表了最大数量的膜或是膜偶联蛋白的数据识别，是首次直接并且是系统的针对蛋白质相对丰度的研究。

”Thermo对于这项技术提供了一系列产品，叫做定量蛋白分析。

很明显的是，质谱技术上的进步已经超过了工具和应用的发展速度，眼下，消费者只对那些能使工作流程流线化、自动化，或是能分析海量数据的产品，再或是将质谱技术推广到临床和医院感兴趣。

（译自《Drug Discovery & Development》）。