成年大鼠心肌细胞分离方法
【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。
方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。
光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。
结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。
结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。
【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离
【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be
isolated well with the above methods.
【KEY WORDS】 Rat; Cardiomyocytes; Cell Separation
心肌细胞不仅保存了心肌结构和功能上的某些特点,同时去除了体内各种限制因素的影响,作为实验工具,具有简便、精确、重复性好等优点,已成为研究心肌结构、代谢、功能、病理生理及其机制的重要工具。
目前乳鼠心肌细胞的分离方法比较成熟，但是由于未成熟心肌细胞和成熟心肌细胞的差异性使得大量来自于未成熟心肌细胞实验的结论难以用于成熟心肌细胞。
特别是近年来, 随着心肌细胞电生理和分子生物学研究的兴起，成熟心肌细胞越来越多的应用于心血管病理生理的研究。
目前分离成熟心肌细胞应用较多的是Langendorff 灌流胶原酶消化法，但是它消化下来的是整个心脏的心肌细胞，如果我们只想了解部分心肌细胞功能时就显示出其局限性，我们根据文献的方法加以改进，探讨三种简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法，为研究心肌细胞生理和病理特性提供了有用的实验模型。
1 材料与方法
1.1 酶消化法
1.1.1 动物健康雄性Wister大鼠（200～300g），军事医学科学卫生与环境医学研究所提供。
1.1.2 试剂 0. 1%胰蛋白酶（GIBCO）, 0. 1%胶原酶Ⅰ(GIBCO) (两种酶均用D Hank s 液配制成0. 1 %的液体,经正压过滤除菌,pH7. 2, - 20 ℃保存)，D Hank s 液（g/L）（NaCl 8.0, KCl 0.4,Na2HPO4 0.7，H2O 0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35）,用双蒸去离子水配制，pH7.2,
高压蒸气灭菌,4 ℃保存。
培养液[10%DMEM(GIBCO) 干粉,由双蒸去离子水配置液体]正压过滤除菌,pH7. 2～7. 4, - 20 ℃保存。
1.1.3 主要器材光学显微镜(Olympus),超净工作台(苏州净化设备有限公司),FA21045N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)
1.1.4 心肌细胞分离
大鼠用25%乌拉坦（1.0g/kg）腹腔注射麻醉，取适量待测心肌组织（下列操作均除水浴和离心外均在超净工作台内进行）立即放入预冷的D Hank s 液中,冲洗3次。
将心室肌用眼科剪剪成1 mm3 大小组织块,然后加入0. 1 %胰蛋白酶溶液10 ml,37 ℃水浴8min 后,吸取上层混悬液移弃。
再加入0. 1 %胶原酶溶液15ml，37 ℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min 后,吸取上层混悬液，放在预冷10%DMEM 中终止反应。
剩余沉淀物再加0. 1%胶原酶溶液15ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min后, 吸取全部液体，终止反应。
混悬液用200目孔径不锈钢网过滤除去未消化组织,在室温下800～1000转/min 离心3～5min，弃上清，沉淀加入培养液2ml,混匀。
1.2 程序冷冻后机械法
1.2.1 动物同上。
1.2.2 试剂DMEM (GIBCO)，Ficoll(Pharmacia) ，Krebs Henseleit 缓冲液（mM）（NaCl 118, KCl4.8, MgSO41.2 ，KH2PO41.2, NaHCO325,Glucose 11，pH7.4），蒸馏水溶解后，经0.22μm滤膜抽滤消毒，备用。
0.1M PBS（mM）（NaCl 138, KCl 2.7, KH2PO41.2,Na2PO4 8.1，pH7.4）, 蒸馏水溶解后，高压蒸汽消毒，备。