产脂肪酶菌株的筛选、鉴定以及酶学性质的研究段盈伊;赵淑琴;韩生义;王琨;高兴富【摘要】[Objective] To screen and identify lipase producingstrain,determine the biology activity of the enzyme produced by the strain.[Method] Lipase producing microbial in oil-rich soil were cultured in neutral red oil medium with olive oil as the sole carbon source for initial screening,the improved copper soap-photometric method was used for secondary screening;the species of the lipase producing strain was identified by morphological observation,physiology biochemistry and 16S rDNA sequence analysis;activity of the lipase was determined by improved copper soap-photometric method.Effect of metal ion,organic solvent and surfactant was assayed on activity of lipase [Result] A lipase producing strain was screened,named as LZ-5.16S rDNA sequence analysis indicated that the strain belong to Staphylococcus epidermidis.The activity of lipase produced by the strain was 4.78 U/mL.The optimum pH and temperature of the lipase were 9.0 and 40 ℃.Lipase activity was stimulated byCa2+,Mg2+ and inhibited by Fe2+,Zn2+,EDTA,SDS,methyl alcohol and ethyl alcohol.The lipase showed better tolerance to glycerol,Na+,andK+.[Conclusion] The strain LZ-5 shows a better lipase activity.%[目的] 筛选高产脂肪酶菌株并鉴定其种属,研究脂肪酶的酶学性质.[方法] 以橄榄油为唯一碳源对富含油污土壤中产脂肪酶微生物进行富集培养,用中性红平板进行初筛,结合改进铜皂分光光度计法测定酶活力;对筛选的高产脂肪酶菌株进行形态学观察和相关生理生化实验,再结合16S rDNA序列分析确定其种属;确定该菌株所产脂肪酶的最适作用温度和pH值,并研究金属离子、有机溶剂以及表面活性剂对酶活的影响.[结果] 筛选得到一株高产脂肪酶菌株LZ-5,其所产脂肪酶的酶活力为4.78 U/mL;菌种鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis).该酶最适作用温度为40 ℃,最适pH值为9.0;Ca2+、Mg2+对酶活力有促进作用,Fe2+、Zn2+、EDTA、SDS、甲醇和乙醇对酶活力有抑制作用,对Na+、K+、丙三醇的耐受力较高.[结论] 成功分离一株表皮葡萄球菌高产脂肪酶菌株.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2017(052)002【总页数】7页(P146-151,160)【关键词】脂肪酶;筛选;鉴定;酶学性质【作者】段盈伊;赵淑琴;韩生义;王琨;高兴富【作者单位】甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q93-331脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)是一类可以在油水界面上高效的将三脂酰甘油酯酯键水解，释放脂肪酸和甘油的生物酶类，广泛存在于动物、植物各种组织及微生物中，是最早研究的酶类之一[1].脂肪酶最早是从动物中发现，1834年Eberl发现了兔胰脂肪酶，1864年发现了猪胰脂肪酶，1871年在植物种子中发现了脂肪酶.微生物脂肪酶直到1901年才被发现，当时的研究人员观察到粘质沙雷氏菌、绿脓假单胞菌及荧光假单胞菌能够产生脂肪酶[2].产脂肪酶微生物种类多、来源广、繁殖周期短，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，其可以在不需要辅酶的条件下催化酯类化合物的水解、醇解、酸解、酯交换及合成等反应，催化条件温和、能耗低、副产物少，具有高效性、高选择性、环境友好等特点，改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件[3]，比动物、植物脂肪酶具有更高的研究和开发利用价值.许多脂肪酶具有较宽的底物范围，因此它们被认为在进化过程中逐步形成了具备利用碳源的能力或与分解代谢途径有关[4]，这使得脂肪酶成为在许多工业加工过程中具有巨大潜力的生物催化剂，用于化学选择性、区位选择性和对映选择性的水解作用及一系列化合物的合成中，如食品调味料的合成，作为添加剂应用于洗涤剂中，并在造纸业和医药领域等相关行业具有多种工业应用价值，已成为人们普遍选择的生物催化剂之一[5].近年来随着非水酶学的不断深入，脂肪酶的应用已超出了油水界面上进行水解反应的范围，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基因保护、高聚物的合成、肽合成、生物能源的生产等方面，是继蛋白酶，淀粉酶之后上第三大工业用酶[6].目前研究发现，约有65个属的微生物可以产生脂肪酶，细菌28个属，酵母菌10个属，放线菌4个属，其它真菌23个属.微生物脂肪酶的研究主要集中于根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicilliffm)、毛霉属(Mucor)、地霉属(Geotrichum)、假丝酵母属(Candida)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)等具有工业应用价值的菌株[7].但实际上能产生脂肪酶的微生物菌种分布远不止这个数目[8]，对脂肪酶微生物资源的开发与利用，特别是低温、高温、动物肠道等一些极端环境中脂肪酶微生物资源具有重大开发潜力，因此在了解脂肪酶催化特性的基础上，筛选具有活力高、产量高等新特性的产脂肪酶菌种，并在获得产脂肪酶菌株后进一步探索其产酶的最适条件，如培养基的配方[9]、最适温度、最适pH值[10-12]等，可以使脂肪酶的应用范围得到进一步的拓展.1.1 试验材料1.1.1 样品在兰州市区餐馆、加油站周边采集被油脂污染的表层土壤样品20份.用灭菌袋子封存，分别编号LZ-1～20，带回实验室进行分离筛选.1.1.2 培养基富集培养基:蛋白胨1 g，葡萄糖1.5 g，牛肉膏0.5 g，NaCl 0.25 g，蒸馏水加至100 mL，pH值为7.5中性红油脂平板:蛋白胨5 g，牛肉膏2.5 g，橄榄油聚乙烯醇乳化液60 mL，NaCl 2.5 g，MgSO4 0.25 g，琼脂7.5～10 g，1.6%中性红溶液0.5 mL，蒸馏水加至500 mL，pH 7.0～7.5发酵培养基:蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，橄榄油聚乙烯醇乳化液12 mL，NaCl 0.25 g，(NH4)2SO4 0.2 g，k2HPO4 0.1 g，MgS04 0.05 g，蒸馏水加至100 mL，pH值为7.0～7.5.1.1.3 试剂葡萄糖、乳糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露醇、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、明胶、琼脂、橄榄油、聚乙烯醇、乙醚、95%乙醇、异辛烷及其他无机盐.1.2 试验方法1.2.1 高产脂肪酶菌株的初筛将采集的土样称1 g重悬于10 mL蒸馏水中，充分搅拌使其溶解，静置20 min，吸取上清液1 mL加入有100 mL细菌富集培养基的三角瓶中，32 ℃、180 r/min摇床发酵培养2 d.用灭菌水将富集培养液分别稀释至10-4、10-5、10-6倍，涂布于中性红油脂平板上，32 ℃培养2 d左右.选取有明显红色变色圈或透明圈的菌落作为目的菌株.1.2.2 高产脂肪酶菌株的复筛将初筛出目的菌株转接入发酵培养基，放入摇床，32 ℃、180 r/min培养5 d，使用改进铜皂-分光光度计法测酶活力[13].取试管加入2.5 mL缓冲液和2 mL乳化液在40 ℃水浴锅中水浴15 min，再加入0.5 mL目的菌株的发酵培养液，继续水浴恒温反应15 min，用1 mL浓盐酸和6 mL 95%的酒精终止反应，再用3 mL异辛烷萃取试管内生成的脂肪酸，将上层清液吸出移至离心管，4 000 r/min离心1 min，使有机相和水相分离澄清.取1 mL 上层清液加入1 mL显色剂和4 mL异辛烷，用分光光度计在714 nm处测D值.空白对照组为先在0.5 mL预热的发酵培养液中加入1 mL浓盐酸和6 mL95%的乙醇，振荡混匀，再将预热的底物-缓冲液加入其中，40 ℃恒温反应15 min，其他后续操作相同.根据酶活计算公式X=(D试验-D对照) ×3/(tV×0.021 )(X为脂肪酶活力U/mL，t为作用时间min,V为酶液用量mL)，计算出酶活力，筛选出酶活力较高的菌株.1.2.3 目的菌株的形态学观察及生理生化试验将分离筛选出的目的菌株接种在LB 平板上，37 ℃培养1～2 d，观察菌落形态，挑取一环细菌材料用压片法进行革兰氏染色，镜检.通过多种糖发酵试验(葡萄糖、乳糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露醇)、精氨酸水解试验、明胶液化试验、硝酸盐试验、触酶试验、吲哚试验、淀粉酶试验和柠檬酸盐试验测定其生理生化特性，并参照《伯杰细菌鉴定手册》[14]的相关描述进行鉴定.1.2.4 目的菌株的分子学鉴定本试验采用天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒，首先提取目的菌株的基因组DNA作为模板，再用16S rDNA保守序列的通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)作为引物，进行PCR扩增[15]，扩增条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，72 ℃再延伸10 min.用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对 PCR 扩增产物进行胶回收，将回收产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序.将测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对，选取并下载相似性99%以上的序列，用Clustal W将目的序列和已下载的序列进行多序列比对，再用MEGA5.10构建系统发育树.1.2.5 目的菌株最适温度测定取试管加入缓冲液和乳化液分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃水浴锅中水浴15 min，再加入目的菌株的发酵培养液，恒温反应15 min，在714 nm处测得D值.计算出酶活力，并以在40 ℃、pH为7条件下测出的酶活为标准酶活计算出相对酶活，确定其最适反应温度.每个梯度设3个重复.用GraphPad Prism6作图，并用SPSS 20.0对数据进行F检验.1.2.6 目的菌株最适pH值测定配置柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，按不同比例配成pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的缓冲液.配置巴比妥钠-盐酸缓冲液，按不同比例配成pH为7.0、8.0的缓冲液.配置碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，按不同比例配成pH为9.0、10.0、11.0的缓冲液.取试管加入不同pH缓冲液和乳化液在40 ℃水浴锅中水浴15 min，再加入目的菌株的发酵培养液，恒温反应15 min，在714 nm处测得OD值.计算出酶活力，并以在40 ℃、pH为7条件下测出的酶活为标准酶活计算出相对酶活，确定其最适反应pH值.每个梯度设3个重复.用GraphPad Prism6作图，并用SPSS 20.0对数据进行F检验.1.2.7 金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活力的影响在有底物和缓冲液的试管中，先加入目的菌株发酵培养液，再分别加入终浓度为2 mmol/L的各种金属离子(Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+、Zn2+)测定其酶活力，再加入EDTA至最终浓度为2 mmol/L，测定其酶活力.再分别加入各种有机溶剂(甲醇、乙醇和丙三醇)至体积分数5%，测定其酶活力.再加入表面活性剂SDS至体积分数1%，测定其酶活力[16].以不加金属离子、有机溶剂和表面活性剂的菌株发酵培养液为对照组.每个梯度设3个重复.用GraphPad Prism6作图，并用SPSS 20.0对数据进行t检验.2.1 菌株筛选通过初筛，分离筛选出5株在中性红油脂平板有变色圈或透明圈的菌株.再经过复筛测定它们水解甘油三酯的相对酶活力，其中编号为LZ-5菌株的酶活力较高，为4.78 U/ml.该菌株在中性红油脂平板上有明显的透明变色圈(图1).2.2 形态学鉴定菌株LZ-5在培养基上的菌落圆型，凸起，表面光滑或稍呈颗粒状，边缘完整.革兰氏染色后，镜检发现为阳性球菌(图2)，单个、成对排列形成不规则的堆团，染色均匀.2.3 生理生化试验结果生化试验(表1)表明，该菌株发酵葡萄糖，乳糖，麦芽糖产酸不产气，硝酸盐还原试验呈阳性，淀粉酶试验呈阴性，触酶试验呈阳性，吲哚试验呈阴性，能水解精氨酸，能液化明胶,不能利用柠檬酸盐作为碳源.2.4 分子学鉴定LZ-5菌株的16S rDNA测序结果表明其为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis strain，序列登陆号：KU950368)，BLAST比对结果表明与Staphylococcus epidermidis strain (CIFRIH-TSB-12-ZMA),Staphylococcus epidermidis strain M-T-MRS 62位于同一族群，16S rDNA序列相似性99%，系统进化树(图3)也支持了这一结论.2.5 脂肪酶最适温度环境在不同温度条件下测定该菌株产脂肪酶的相对酶活.对数据进行分析，F检验的结果表明P<0.05，说明温度对相对酶活有显著性影响.发现该酶在30～45 ℃范围内活性较高，最适作用温度为40 ℃(图4).2.6 脂肪酶最适pH环境在不同pH值的缓冲液中测定该菌株产脂肪酶的相对酶活.对数据进行分析，F检验的结果表明P<0.05，说明pH值对相对酶活有显著性影响.发现pH值为6.0～9.0的范围内酶活性较高，最适pH值为9.0(图5).2.7 金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活的影响测定金属离子、有机溶剂和表面活性剂对该菌株产脂肪酶的相对酶活.对数据进行分析，t检验的结果表明，Ca2+、Mg2+对酶活有较明显的激活作用；Na+对酶活有微弱的刺激作用；K+对酶活的刺激作用不显著；Fe2+，Zn2+对酶活有抑制作用；EDTA则使脂肪酶基本失活；脂肪酶对甲醇、乙醇耐受力较差，但对丙三醇的耐受力较高，而SDS也使脂肪酶基本失活(图6).初筛菌株选用的是中性红油脂平板，菌落产脂肪酶可利用作为碳源的橄榄油底物生长并且水解其产生脂肪酸，使菌落周围变为酸性环境，中性红指示剂显深红色，从而在菌落周围形成红色透明圈.通过这种方法筛选目的菌株灵敏度高且操作以及观察起来较方便.在以橄榄油为底物的脂肪酶酶活检测方法中，主要是通过检测脂肪酸的生成速度来测定酶活，用铜离子对萃取出的脂肪酸显色测定脂肪酶活力的方法，避免了直接酸碱滴定法中缓冲液的缓冲性和乳液对滴定结果的影响，并在改进方法中采用无毒的异辛烷代替苯萃取乳液中的脂肪酸，由于该方法的测定不受反应体系的缓冲溶液的影响，测得的酶活力曲线更准确.改进的铜皂法具有毒性小、结果稳定、重复性好的优点.最终筛选到的产脂肪酶菌株LZ-5，经形态学观察，生理生化试验，16S rDNA分子鉴定，证实为表皮葡萄球菌.细菌类产脂肪酶的菌属种类较多，主要分为两大类：革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌.革兰氏阳性菌包括芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、微球菌属等，革兰氏阴性菌包括假单胞菌属、气单胞菌属等.葡萄球菌是人和动物的临床条件致病菌，目前为止，已有来自10种不同葡萄球菌种的13个胞外脂肪酶在基因水平上得到了鉴定，其中3个分离自表皮葡萄球菌，2个分离自金黄色葡萄球菌，各1个分别来自其他葡萄球菌.大多数细菌脂肪酶最适作用温度和pH范围分别为35～45 ℃和8.0～9.0，个别如洋葱伯克霍尔德菌ZYB002最适温度达65 ℃.而葡萄球菌脂肪酶最适pH高达10.0，在30～60 ℃和pH 4.0～10.0之间，具有较好的稳定性，体现其较好的耐碱性.不同细菌脂肪酶底物特异性不同，如Burkholderia cepacia对中短碳链脂肪酸(C8～C12)有特异性，而Staphylococcus epidermidis则对长链脂肪酸(C18：0)有特异性[17].表皮葡萄球菌作为近年来发现的产脂肪酶菌种，为皮肤表面条件性致病菌株来研究较多.筛选出的表皮葡萄球菌在脂肪酶研究方面具有一定的价值.表皮葡萄球菌脂肪酶具有的水解酯类特性使得其能够作为酶添加剂应用于洗涤剂中.酶添加剂相比传统合成洗涤剂，其优势在于酶能够在更广的温度范围下催化油脂的分解，除此之外还减少了对环境的污染[18].而且在造纸业中，在纤维素酶和木质纤维素酶的辅助作用下，用脂肪酶处理纸浆能够去除树脂和蜡等物质，避免纸张严重破裂，不仅减少了处理树脂所需要的化学品的用量，还能够保持纸的质量和产量[19].另外每年由于各种原因排入海中的石油达200万t，如不及时处理，不仅会造成鱼类的大量死亡，而且石油中的有害物质也会通过食物链进人人体.这时用含有脂肪酶及其它成分的复合制剂处理海中的石油，可以将石油降解成适合微生物的营养成分，为浮在油表面的细菌提供优良的养料，使得分解石油的细菌迅速繁殖，以达到快速降解石油的目的.脂肪酶生物技术应用于被污染环境的修复以及废物处理是一个新兴的领域，还需要进一步研究和开发.【相关文献】[1] Qu Yen D T,Sshimdt-Dannert C,Sxhmid R D.High-level expression of a lipase from Bacillus thermocate nulatus BT L2 in Pichia pastoris and some properties of the recombinant lipase [J].Protein Expression and Purification,2003,28(1):102-110.[2] 韦宇拓,滕昆.脂肪酶的分子结构及应用研究进展[J].广西科学,2014，21(2)：93-98.[3] Contesini F J，Lopes D B，Macedo G A，et al．Aspergillus sp．lipase：potentialbiocatalyst for industrial use[J]．Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2010，67(3)：163-171．[4] Phytian S J．Esterases．Biotechnology-Series[M]．Weinheim：Wiley-VCH，1998：193-241．[5] 孙新城,马淑玲,张玲丽,等．一株高产脂肪酶产生菌16S rDNA的序列分析[J].南方农业学报，2012,43(9)：1269-1272．[6] Hasan F，Shah A A，et al．Industrial applications of microbial lipases[J]．Enzyme and Microbial Technology，2006，39(2)：235-251．[7] Kang H Y，Kim M H，Mel D B．A database formiernbial esterases and lipasesR[J]．FEBS Letters，2006，580(11)：2736-2740．[8] 刘虹蕾,缪铭,江波,等.微生物脂肪酶的研究与应用[J].食品工业科技,2012,12:376-381.[9] 孙国政,甘伯中,艾对元,等.牦牛乳酥油源白地霉S122产脂肪酶培养基的优化[J].甘肃农业大学学报2013,48(1):135-139.[10] 王挥,张蕾,黎继烈,等.响应面法优化黑曲霉发酵产单宁酶条件[J].中南林业科技大学学报,2011,31(10):122-126.[11] Branco R V,Gutarra M L,Guisan J M.Improving the thermostability and optimal temperature of a lipase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus by covalent immobilization[J].Biomed Res Int,2015:250532.[12] Zhang T,Peng Y,Yu Q.Characterization of the 5’ flanking region of lipase gene from Penicillium expansum and its application in molecular breeding[J].Biotechnol Appl Biochem,2014,61(5):493-500.[13] 侯爱军,徐冰斌,梁亮,等.改进铜皂-分光光度计法测定脂肪酶活力[J].皮革科学与工程,2011,21(1):22-27.[14] 布坎南 R E,吉布斯 N E.伯杰细菌鉴定手册[M].8版,北京:科学出版社,1984:382-462.[15] 刘朝军,沈定霞.16SrDNA序列测定在细菌鉴定中的应用[J].军医进修学院学报,2011,32(7):774-776．[16] 王欢,何腊平,周换景,等.脂肪酶活力测定方法及其在筛选产脂肪酶微生物中的应用[J].生物技术通报,2013,1:204-208．[17] 黄璜,李宗军,王远亮,等.各类微生物脂肪酶酶学性质及应用的研究进展[J].粮油食品科技,2014,22(1):109-118.[18] Cardenas F,Alvarez E,de Castro Alvarez M S,et al．Screening and catalytic activity in organic synthesis of novel fungal and yeast lipases[J].J Mol Catal B：Enzyme，2001，14：111-123．[19] Jaeger K E，Reetz T M．Microbial lipases from versatile tools forbiotechnology[J]．Trends Biotechnol，1998,16：396-403．。