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[试剂]
❖ Acr-Bis ❖ TEMED、AP ❖ Ampholine ❖ 电极缓冲液（5%H3PO4、2%NaOH）
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[操作]
1.凝胶的制备 2.电泳 3.剥胶 4.观察结果
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[结果]
pI HbA 6.87
HbF 6.98
HbA2 7.38
c
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端 c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
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在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电 场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质 带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移 动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来， 即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。
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讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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四、IEFE的应用 Applications of IEF
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEF作为第一相
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㈡引入电场时的变化
载 体 两 性 电 解 质 (carrier ampholytes)分子将向阴极 (cathode) 或 阳 极 (anode) 迁移，带有最低等电点的分 子（荷最多的负电）将最快 地向阳极迁移。当它达到净 电荷是零的位置时才停止。
其次一些低pI的载体两性 电解质分子（荷其次多的负 电）也将向阳极移动，直到 它的净电荷被减少到零才停 止。
3.pH梯度的形成
载体两性电解质(Carrier ampholytes)是一 系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后， 它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH 梯度(pH gradient)。
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㈠没通电时的变化
所有的载体两性电解
质
(Carrier
ampholytes) 分 子 都 荷电，只是溶液中荷 正电和荷负电的基团 数目相等，净电荷 (net charge)为零。
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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二、IEFE的特点
（一）优点
❖High Resolution ❖High Sensitivity ❖Good Reproduction
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（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能 发生沉淀。
在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另 外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放 的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化
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由于载体两性电解质(carrier ampholytes) 是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组 成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH’，当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正极移 动。
Hb具有四条多肽链 （α、β、γ、δ）
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HbA 正常成人血中主要的Hb成分。 HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分，当
胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2% 至2.6%左右，最高范围一般 不超过3.5%。
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HbF 1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的主要
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不 溶或发生变性的蛋白质。
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分辨率(resolution)较不连续PAGE更高， 特别适合于分离分子量(molecuar weight,MW)相同而电荷(electric charge)不 同的生物大分子。
Q M = ——
6r
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双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）
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考马斯亮蓝
银染
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讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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实验 血红蛋白的等电聚焦电泳
在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrier ampholyte)，当通以直流电时，两性电解质
即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度， 在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于 其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一 个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称 为聚焦电泳。
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讲课内容
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好
的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，
在电泳介质中放入载体两性电解质(carrier ampholytes) ，当通入直流电时，两性电解质形 成一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加 的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高 pH区。
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蛋白质分子的电聚焦过程
+
pH=pI
-
—
a
b
pI1
+ pI2
pI3 pIn
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
李莉
/
讲课内容
1
IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等 电点（isoelectric point，pI)不同的蛋白质 的电泳技术。
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的 pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品 不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带
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（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质(ampholytes)混合物建立 稳定良好的pH梯度
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讲课内容
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IEFE定义
2
IEFE的特点
3
IEFE的基本原理
4
IEFE的应用
5
血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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三、IEFE的基本原理
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蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+
P
P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 COO-
pH＜pI
pH＝pI
pH＞ pI
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不干扰样品的测定。
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2.载体两性电解质的合成
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺
Ampholine（LKB）
本质：一系列脂肪族(aliphatic ampholytes)多 氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相 同又十分接近相互连接的pI值。
pH范围：pH3~10
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成分，足月的初生婴儿血中大约有70-80%为 HbF，其余为HbA。婴儿出生后不久，HbF的 浓度迅速减少，同时HbA相应增多，绝大多数 正常人于出生后6个月至2年后，HbF便降至成 人的正常浓度，以后HbF一直存在。
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[器材]
❖ 电泳仪 ❖ 凝胶玻管 ❖ 三角烧杯 ❖ 10cm长针头
Isoelectric focusing (IEF), is a technique for separating different molecules by their electric charge differences.
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等电聚焦(Isoelectric focusing ,IEF)就是
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[思考题]
1.PAGE与IEFE有何区别？ 2.本实验的关键步骤是什么？
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参考书目
《蛋白质电泳实验技术》 科学出版社 郭尧君 《蛋白质技术手册》 科学出版社 汪家政 范敏 主编 《电泳》 科学出版社 何忠效 张树政 主编
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The proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI .
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当环境pH<pH’时，它带正电荷，朝负极移动， 直至移动到它的等电点处，在那里聚集。由于两 性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力，因 此在它附近形成一个pH稳定区域。
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同样载体两性电解质(carrier ampholytes)中 各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点 (isoelectric point,pI)处，由于它们的数量足 够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个 pH梯度。