毕业论文开题报告生物工程高性能淀粉酶菌株的筛选1 选题的背景和意义淀粉酶是能催化淀粉和糖原水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称，在淀粉糖工业、食品工业、医药、纺织、洗涤剂、青贮饲料、微生态制剂以及酿酒行业中被广泛应用。

淀粉酶是最早用于工业化生产并且迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一[1、2]。

不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的产物。

根据淀粉酶水解淀粉的作用方式可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。

α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，又称为液化酶；β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末端切下一分子的麦芽糖，又被称为糖化酶，其产物还原性末端葡萄糖单位碳原子为β构型；葡萄糖淀粉酶是从底物非还原末端依次水解α-l，4糖苷键和分支的α-1，6-糖苷键，生成葡萄糖。

异淀粉酶是只水解糖原或支链淀粉分支点的α-1，6-糖苷键，切下侧枝链[3]。

淀粉酶是工业中最重要的酶。

如今，在生物制药领域，它也具有重要的作用。

虽然淀粉酶具有很多来源，但是微生物来源的淀粉酶，特别是α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商业上发挥着重要的作用。

由于淀粉是可以由淀粉酶水解的惟一天然物质，分离有效的微生物菌株生产对生淀粉有效性高的淀粉酶是非常理想的。

应用新的耐热性葡糖淀粉酶可以促进淀粉的水解过程，而使用α-淀粉酶可以使整个过程一步便可以完成，具有经济效益。

现在，必须开发具有双重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。

也应该开发具有有效β-淀粉酶活性的菌株，β-淀粉酶可以用来生产麦芽糖浆。

可以用农业和工业上的废物作为淀粉酶生产的底物，从而降低开支，也解决了废物的处理和污染问题。

在工业上的作用，淀粉酶的耐热性已成为非常重要的性质，因此，我们也应该努力从耐热和极端耐热的微生物中生产淀粉酶。

另外，将淀粉酶的应用范围拓宽如应用于生物制药领域也具有积极的意义。

2 相关研究的最新成果及动态2.1 α-淀粉酶的催化机理目前公认的α-淀粉酶的催化机理[4]，催化中心位于α/β桶状结构的底部，261位谷氨酸和231位天冬氨酸是起催化作用的两个重要残基。

整个催化过程可分三步：第一步，淀粉链中的糖苷氧被质子供体261谷氨酸质子化；第二步，亲核基团231位天冬氨酸亲核攻击葡萄糖残基的C1，糖苷键断裂，葡萄糖残基与231位天冬氨酸形成酯键，同时去质子化状态的261位谷氨酸夺取一个水分子H+，产生一个OH-；第三步，OH- 攻击葡萄糖残基的C1，使酯键断裂，261位谷氨酸和231位天冬氨酸重新恢复初始状态。

在已知结构的α-淀粉酶中，在α/β桶状结构的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸两个残基，它们的相对位置相似，并且所有α-淀粉酶的整体三维结构都很相似，因此，它们的催化反应机理应该是相同或相近的[4、5]。

以对α-淀粉酶分子结构和催化机理的研究为基础，通过各种手段改善酶的催化反应特异性，使其更适合于在工业生产中应用是近年来新兴的发展趋势。

2.2 α-淀粉酶的突变研究目前应用得最广泛的基因水平上的突变主要有两种，即随机突变和定点突变，有时也将两种方法结合使用。

随机突变首先需构建突变文库，然后根据研究酶的特点设计高通量的筛选方法。

它的优点是不必明确知道酶的三维结构、催化机理等。

定点突变需要对酶的结构机理有较明确的认识，它更适用于研究单个或多个位点对酶分子的影响。

将这些方法应用于α-淀粉酶的研究已有一定进展。

目前有关突变的研究大多针对于地衣芽胞杆菌活菌，如Takase 研究发现天冬酰胺326赖氨酸/天冬氨酸能够显著改变地衣芽胞杆菌活菌的pH特性。

Nielsen J E等对地衣芽胞杆菌活菌进行定点突变，发现谷氨酰胺264丝氨酸和天冬酰胺190苯丙氨酸能提高地衣芽胞杆菌活菌的热稳定性。

Shaw A 等通过随机突变，得到Met15Thr,能增强地衣芽胞杆菌活菌的稳定性，在此突变的基础上进行随机突变，发现Met15Thr和天冬酰胺188丝氨酸使地衣芽胞杆菌活菌热稳定性提高2倍[6]。

但目前就氨基酸突变如何导致酶宏观性质的改变说法不一，还有待进一步研究。

2.3基因克隆及氨基酸序列分子生物技术的发展，对α-淀粉酶的研究已进入分子水平阶段，在α-淀粉酶的氨基酸序列分析、基因编码及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性状表达等方面都取得较大的进展，基因工程技术已广泛应用到了淀粉酶生产菌株的克隆上，并且在不同微生物的α-淀粉酶基因克隆方面已经作了大量的工作，主要在大肠杆菌等。

Suganum a et al. 研究了α-淀粉酶的N-端氨基酸序列。

Kim et al. 描述了编码一种新α-淀粉酶的基因，该基因被克隆并在大肠杆菌中表达[7]。

Steyn 和Pretorius 编码α-淀粉酶基因(AMY)编码GA的基因(STA 2)转入一个酵母菌的整合载体(Yip5)，形成重组质粒pSP1和pSP2，AMY和STA 2被一同连接到载体Yip5中，产生质粒pSP3。

随后，编码抗Geneticin 418 显性标记的A PH 1 被克隆到pSP3 中得到pSP4。

为了增强Geneticin 418的表达，pSP4再连接启动子GAL10和终止子URA3，这样就得到质粒pSP5。

pSP5通过增加ARS1H和CEN4序列被修改成环形微染色体pSP6。

转入了pSP1-pSP6 的实验室郎酒酵母菌株能稳定产多种α-淀粉酶和GA [7]。

3 课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标本课题希望通过对曲和其他不同来源的淀粉酶产生菌的比较，筛选获得淀粉酶活力较高及生产性能较好的菌株1株，对其产酶条件及酶学性质进行研究。

实验具体内容包括：(1)产淀粉酶菌株的筛选；(2)产酶菌株的鉴定；(3)菌株发酵条件的优化；(4)酶学特性的研究。

3.1产酶菌株的筛选流程图（如上）3.2菌种来源曲和其他不同来源的淀粉酶产生菌。

3.3培养基采用淀粉固体培养基分离培养。

称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g 溶于900mL 蒸馏水中，再加入25g琼脂粉并搅拌至充分溶解，调pH 至中性，最后加蒸馏水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌[2]。

3.4初筛方法称取酒曲5g，倒入盛有无菌水带玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡后制成土壤悬液记为10-1土壤稀释液。

用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此分别制成10-2～10-9的稀释液，分别取10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5 mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种到数个平板，恒温培养，待长出菌落后，滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，进行斜面培养，作为初筛菌株编号保藏[8]。

3.5复筛方法把初筛出的菌株划线到不同编号的平板培养基上，恒温培养一段时间，长出单菌落后，选择直径相当的单菌落，滴加卢戈氏碘液，用游标卡尺测水解圈直径，选取水解圈直径相对较大的菌株作为复筛菌株即实验菌株，进行菌种鉴定及产酶条件优化[9]。

3.6细菌鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》,鉴定项目包括：形态观察、革兰氏染色、芽孢染色、糖发酵、V-P试验、淀粉水解、木糖产酸、柠檬酸盐试验及耐盐性试验等[10]。

3.7响应面法优化温淀粉酶发酵条件在优化初期利用Plackett-Burman（简称PB）设计法，将初始发酵培养基的8种成分：可溶性淀粉（X1）、尿素（X2）、K2HPO4（X3）、KH2PO4（X4）、MnSO4·H2O（X5）、MgSO4·7H2O （X6）、豆粕（X7）和酵母膏（X8），分别作为PB 试验设计的8 个因素，每个因素取2～3个水平，即低水平（-1）为初始发酵培养基各成分的浓度，高水平（+1）取低水平的1.5 倍。

活菌含量作为响应值Y[11、13]。

根据PB试验筛选出的对发酵液活菌含量影响显著的因素、以各显著因素的正负效应确定最陡爬坡试验的路径，快速的逼近最大响应区域。

Box-behnken 设计Box-behnken 设计适用于2～5个因素的优化试验，基于PB 试验设计和最陡爬坡试验的试验结果，进行Box-Behnken设计：以PB试验筛选得到的对发酵液活菌含量影响显著的因素作为设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为中心点，根据相应的试验表进行试验后[11]，使用SAS对试验结果进行响应面分析[12]。

3.8酶学特性研究3.8.1酶活测定淀粉酶酶活定义：1 mL酶液（或1g固体酶粉）在pH 6.0，温度60℃，1min液化可溶性淀粉1mg所需的酶量称为一个酶活单位（U）。

测定：2 %可溶性淀粉溶液10mL，pH6.0磷酸二氢钠—磷酸氢二钠缓冲液2.5mL于60℃下水浴预热5min后，加入稀释一定倍数的酶液0.5mL反应5min，用0.1mol/L的盐酸0.5mL终止反应。

取1mL反应液于5mL比色碘液中，用比色碘液做空白样，测其660nm吸光度A660。

根据A660与酶浓度C的回归方程式计算出C。

酶活力=C×稀释倍数×16.7[14]。

3.8.2酶的性质分析[15]（1）酶反应的最适温度：将酶溶于pH 4.0的磷酸缓冲液中，在4～100℃范围内，不同温度下测定酶活性，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力；(2)酶反应的最适pH：将酶溶于范围在2.6～7.6之间，不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，于最适反应温度下测定酶活力。

以最高酶活力为100%，计算相对酶活力；（3）酶的热稳定性：将酶溶于pH4.0的磷酸缓冲液中，在不同温度下处理不同时间后冷却，分别测定酶活力，以未经热处理的酶所测得的活力为100%，计算相对酶活力；（4）酶的酸稳定性：将酶溶于范围在2.6～7.6之间，不同pH的磷酸缓冲液中，在37 ℃下放置不同时间后，测定酶活力。

以未放置于4℃下保存的酶所测得的活力为100%，计算相对酶活力;（5）酶的Km 值测定：以可溶性淀粉为底物，在pH 4.0，60℃的条件下以不同浓度(S)的可溶性淀粉为底物溶液,测定酶的反应速度V(以单位时间内吸光度的减少量dA/dt来表示)，以1/V21/[S]的双倒数法作图，计算Km值；（6）金属离子对酶活性的影响[16、17]：分别配置含有5mmol/L的不同金属离子的等量酶液，充分混匀后，在适当温度下下放置一段时间后，pH4.0条件下测定酶活力。

以未含金属离子的酶活力为100%,计算相对酶活力。

3.9 重点难点高活力淀粉酶菌株的筛选；淀粉酶的酶学性质研究。

4 论文工作进度和安排2010.10.30 选题2010.11.5 布置论文任务2010.11.5－2010.12.30 查阅文献资料，翻译英文文献，完成文献综述和开题报告2011.1.10 文献综述、开题报告和翻译文章定稿并上交2010.11.5-2011.1.10 熟悉实验室环境和基本实验操作，准备实验所需基本材料2011.4月前在学校指定时间完成开题答辩2010.11.5－2011.5.12 毕业论文实验阶段2011.5.13 完成并提交毕业论文2011.5 在学校指定时间进行毕业论文答辩2011.6 完成并提交答辩后的修改论文5 参考文献[1] 孙晓菲,李爱江.α-淀粉酶的应用及研究现状.[J].畜牧兽医科技信息,2008(6):13-14.[2] 张双民.土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化.[J].土壤肥料,2006(2):59-60.[3] 颜守保.产耐酸性α-淀粉酶菌株的筛选,发酵条件及酶学性质研究.[D].安徽农业大学,2007[4] Sivaramakrisshan S,Gangadharan D,Nampoothiri K M,et al.α-Amylase from microbial sources-an overview on recent development. Food Technol. Biotechnol[J].2006, 44 (2) ,173-184 [5] N ielsen J E, Borchert T V. Protein engineering of bacterial alpha-amylases [J].Biochim Biophys Acta, 2000,1543(2):253-274[6] 王楠,马荣山.耐高温α-淀粉酶的研究进展[J].中兽医医药杂志,2007(3)[7] 胡欣洁,邓斌,胡承. 微生物α-淀粉酶的研究进展[J].中国防伪,2005(9):59-60[8]魏群.分子生物学实验指导（第二版）[M].北京:高等教育出版社,2007.[9]陈均辉,李俊,张太平,等.生物化学试验（第四版）[M].北京:科学出版社,2008.[10]伯杰细菌鉴定手册（第八版）[M].北京:科学出版社,1984.[11]陈雄,袁金,凤王志,等.响应面法优化地衣芽孢杆菌A2发酵培养基[J].中国饲料,2009,7:17-20[12]欧宏宇,贾士.SAS软件在微生物培养优化中的应用[J].天津轻工业学院学报,2001,1:[13]茆军,张志东,王玮,等.响应面法优化低温淀粉酶发酵条件研究[J].生物技术, 2008,18(4):83-86[14]蒋若天,卢涛,宋航.一株α-高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌产酶培养基的优化[J].现代食品科技,2006,22(4):52-56[15]李勃,党永,马瑜,等.黑曲霉Tx-278耐酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究[J].微生物学杂志,2008,28(4):30-34.[16]Rezahi S, Hosseinnim K K.A Ca2＋independentα-amylase that is active and stable at low pH from the Bacillus sp1 KR28104[J].Enz yme Microb.Technol. 2005, 36(3):666-671[17] 柳辉,杨江科,闫云君.产α-淀粉酶菌株的分离,鉴定及酶学性质研究[J].生物技术,2007(17):34-35.。