构造模式图
光学系统
流动室及液流驱动系统
激光光源及光束形成系统
1、 Fluidics Subsystem 流动室与液流驱动系统
• 流动室：核心部件，样品在此与激光相交； • 液流层流原理：鞘液（PBS或去离子水），使流动细胞拉开 距离，单个细胞通过； • 要求分辨率高的样品（DNA）应用低速：周期
分选指标：效率、纯度和得率
三、实验中注意事项
1、样品准备 1）原代细胞（骨髓、血液）；2）培养的细胞 单细胞悬液：上机前过膜 2、染色 1）荧光染料的选择：荧光强弱 2）多色搭配：激发光和发射光谱 3）染色条件：抗体浓度、冰上/4度，避光 4）同型对照，阴性对照，单阳管
非常用组合 • PE-texas red/PI PE • PE-Cy5 Percp-Cy5.5/Percp • PE-Cy5 APC
流式细胞术（Flow cytometry，FCM）
以流式细胞仪为主要工具，对处在快速直线流动状态中 的细胞或生物颗粒细胞的各种成分进行多参数、快速的和优势
特点:
单细胞，也能区分群体细胞 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、单细胞克隆等； 定量的 多参数测量和分析（散射光和荧光，可多达27色） 快速测量和分析（每秒可达1000-10000个细胞） 分选细胞的高纯度（可达99%）；
基本构造
1） Fluidics Subsystem ——保证细胞单个通过检测区 2）Optics Subsystem: excitation components ——使检测细胞发出继发荧光 Optics subsystem: collection components ——规范散射光、继发荧光 3）Electronics subsystem ——将光信号转化为电信号，使检测结果完 美的表达出来 4）Sorting subsystem ——保证细胞的分选功能
Aria III
Influx
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488nm
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4、 Electronics subsystem 信号检测与分析
光信号
PMT
电信号
散射光信号
• 散射光信号不依赖任何样品的制备技术，物理参数。 –FSC(Forward Scatter)前向散射角：反应细胞大小和 表面积，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品 中的各种碎片。 –SSC (Side Scatter) 侧向散射角：与激光束正交90度 的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。 • 散射光信号波长与激光相同。
Protocol
• BD • ebioscience • biolegend • Nature protocol
谢谢！
荧光信号
• 自发荧光 • 特征荧光：一种是经过特异荧光素标记后，受激发光照射 得到的荧光信号。
散射光
荧光
（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料
荧光染料 FITC PE(RDI) ECD PeCy-5 PeCy-7 PI APC APC –Cy7 激发波长（nm) 488 488 488 488 488 488 633 633 发射波长（nm) 525 575 620 670 755 620 670 670 颜色 深蓝色 橙色 橙红色 红色 深红色 橙红色 红色
流式细胞仪原理与应用
FLOW CYTOMETRY (FCM)
Presented by Hao Sha 10-13-2012
一、FCM概况 二、基本构造和原理 三、实验中注意事项
一、FCM概述
流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM):
是集合光电子物理、光电测量技术、液流技术、计算机 技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。
荧光信号的面积和宽度：FL2-A,FL2-W
光谱重叠的校正：补偿
两色以上荧光分析存在 光谱交叉
所有补偿调为 “0” 调节电压，用同 型对照或阴性对 照，使阴性群位 于“左下角” 依单阳群体调节 荧光补偿
FCM测量数据的存贮、显示和分析
数据的显示常用以下几种方式：
5、Sorting
Nozzle and sheath pressure Sort gate Sort mode
流式细胞仪图片
BD FACSCalibur
BD Accuri® C6
LSR II
BD FACSC Aria II
BD Influx
二、基本原理和构造
• 用一定压力将待测样 品压入流动室，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘 液管喷出，包绕着样品单行排列并高速流动，依次通过检测区域。以 激光作为发光源，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束 的照射下，产生散射光和激发荧光。
光学系统的结构
LSR II 355nm 375nm 405nm Pacific Blue Alexa Fluor430 BD Horizon™ V450 FITC Alexa Fluor488 PE PI/PE-Texas Red PE-Cy5 PerCP-Cy5.5 PerCP/7-AAD PE-Cy7 561nm 633nm APC Alexa Fluor 647 Alexa Fluor700 APC-Cy7 APC-H7 Alexa Fluor780 DAPI/Hoechst
上机检测
1、开机：（平台老师负责） 照UV，仪器激光、液流、QC 2、检测 1）样品：单细胞（过膜），浓度合适 分析：<10000 events /s 3000～5000/s 检测DNA含量时应低速
分选：1～2×107 cell/ml ，10000 events/s左右 2）阈值：默认5000，我一般用25000，去除碎片 （骨髓和血液） 3）设门 4）补偿：两两之间，补偿一般应<20 5）数据保存：experiment and FCS
能量传递染料：
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发 光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。
CY7
488nm
PE CY7
Laser CY7
荧光信号的线性测量与对数测量： 荧光信号——PMT——电信号——放大器 放大器：线性放大（lin）：DNA、RNA、protein 对数放大（log）：细胞膜表面抗原
LSR II：355nm，405nm，488nm，633nm Influx： 355nm，405nm，457nm，488nm，532nm，561nm，640nm
3、光学系统： collection components
• 由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧 光信号分别送入到不同的电子测控器。 • 主要光学原件：滤光片(Filter) – 长通滤片 Long Pass Filter, LP（ >500nm） 650/60 – 短通滤片 Short Pass Filter, SP（<500nm） – 带通滤片 Band Pass Filter BP（450～550nm ）
6）模板保存，数据及时拷走备份 7）数据分析：BD Diva 和 Flowjow 3、仪器清洗 分析：洗液1——外管15s，内管10min 洗液2 ——外管15s，内管10min ddH2O ——外管15s，内管10min 如果有人继续测，ddH2O，standby。 分选：洗液1——20～30min ddH2O——30min
FITC PerCP-Cy5.5 PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 PE-Cy7 APC Alexa Fluor700
PE PE-Cy7 APC PE APC-Cy7 APC-CY7
补偿
/cn/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp
Injector Tip
Fluorescence signals
Sheath fluid
Focused laser beam
液流与流速控制
2、光学系统：激光光源及光束成形系统 excitation components
激光：一般选配2～4跟激光，如355nm，405nm，488nm，633nm等； 国内最多6激光27色，国外最多7激光。 激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约22×66μm 的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。
流式细胞仪的测量对象
大小 0.2~300um
对象类型 细胞类型： （1）高等真核细胞;（2）酵母； （3）细菌;（4）多细胞的聚集体，如胰岛等 非生命颗粒： 细胞核、染色体、其它细胞器以及乳化微球等。
流式细胞仪的类型
临床型——小型，科研与临床结合型。 科研型——大型，基础研究和加速分选型。 新型流式细胞仪——2～7根激光管，可检测27个参数。高 速分选，50000个/sec。 目前国内主要流式细胞仪厂家： Beckton Dickinson(BD)公司 BACKMAN COULTER公司