纯化操作规程
1 纯化内容及目的
纯化前，详细咨询合成人员，并记录下列内容：
1.1 样品名称
纯化命名时严格承接合成名称。

详见《技术部产品批号编制》。

1.2 样品重量
此处指经裂解后直接上机前样品重量。

无论对于已抽干样品（多呈粉末状，与实际重量相近）或某些尚未抽干或者未进行抽干处理的样品（多呈粘稠溶液状或胶状，其重量与实际重量相差可能较远），都需详细记录。

1.3 预计目的肽含量
指样品中含有目的肽的大致mg数，由合成人员提供。

1.4 要求的目的肽数量及纯度
即产品指标，如不同纯度（如仅脱盐、或80%、90%、95%等）以及相应的mg数。

1.5 后处理方法
样品在合成过程中，后处理方法的不同，可能对纯化方法与结果判断有一定影响。

此时应详细咨询合成人员并记录。

2 样品溶解性能的预备实验
鉴于肽类样品的等电点（pI）、溶解性能将直接影响到纯化工作。

为谨慎起见，在处理新样品前，必须对其溶解性能进行预备实验。

2.1 理化性质分析
首先利用蛋白分析软件对目的肽的理化性质进行序列分析，主要包括：分子量、pI、疏水性与亲水性、最大吸收峰等，并记录。

2.2 粗肽成分分析
合成时的不同处理方法对于样品所含组分也有很大影响，应详细咨询合成人员该样品合成与裂解过程中是否有特殊处理、合成过程中对该样品的性质有何体会等。

2.3 实验程序
理化性质对于样品纯化仅具有部分指导意义，对于粗肽而言，其许多性质在盐溶液中都会发生变化，一切均以实际验证为准。

2.3.1 取少量样品（10mg左右）加入到洁净试管；
2.3.2 加入2ml过滤无热源水，置于旋涡混合器快速混合2~3min，观察是否完全溶解。

如溶
解，则视为易溶样品（>5mg/ml），可进行大量溶解。

否则进行下一步。

2.3.3 以pH试纸粗略测定样品溶液pH值（多显酸性），结合pI值，以0.1M NaOH或0.1M HCl
逐滴加入，并不断混合或搅拌，直至样品溶解，此时测定溶液pH值（需控制在pH2~10之间为宜，视不同类型柱子而定）。

如不溶则进行下一步处理。

2.3.4 振荡或搅拌下，逐滴加入ACN，至浓度为5~10%，混合，观察是否溶解。

2.3.5 一般样品通过上述处理均可溶解，如最后仍观察到不完全溶解，则选取最佳条件，仍按
大量溶解方法处理。

3 样品大量溶解
3.1 操作要求
粗肽溶解时体积应尽量小，因而溶解液浓度一般很大,此时即使溶液极小的损失也意味着整个样品较大的损失，所以要求一定操作严格，手法熟练，回收细心。

3.2 操作程序
3.2.1 选取合适的溶解液
如已确定方法的样品，一般以初始洗脱液（或其它已证实有效的溶液）；对于新样品，采用预备实验确定的最适宜的溶解条件。

3.2.2 溶解
首先将样品仔细称重，注意记录样品名、称取数量、剩余瓶重等。

对于易溶样品,以一次性注射器吸取适量溶解液,加入，适当超声振荡，使之完全溶解；
对于部分溶解样品,转入试管中,加5ml溶解液,在旋涡混合器上快速混合5min(注意混合均匀、不可洒出)。

离心(注意平衡)10min(3000rpm)。

取出上清液,将底部沉淀以溶解液复溶。

再次离心,复溶,直至试管内无沉淀。

经反复溶解后,仍存在的不溶性颗粒,必须收集待查,不应轻易弃去，必须收集留用。

对于整瓶溶解的样品，以一次性注射器吸取溶解液，仔细冲洗杯壁附着的样品，并回收。

注意：在此过程中，以及以下的整个纯化实验过程中，均采用经高温灭菌的玻璃器皿。

3.2.3 过滤
装滤器。

选择合适大小的滤器及水相滤膜，将滤膜在溶解液中浸润后安装，以注射器打入空气检验是否泄露。

过滤。

以一次性注射器吸取少量样品溶液（2ml）进行过滤。

注意用力均匀，力过大会使液体由滤器接缝处挤出甚至使滤膜破裂损失样品。

滤液应澄清。

多次过滤后，如滤膜堵塞，换新膜。

取下的滤膜置于烧杯中备用，最后以溶解液超声波处理，回收。

样品溶液应仔细回收，滤膜最后吸取溶解液进行过滤以冲下滤器中样品溶液，回收。

滤器处理：滤器用后，取下滤膜，置于盛有1M NaOH的容器中，集中处理（煮沸15min，无热源水洗净，测pH接近中性后，再加入无热源水，煮沸5min，继续以无热源水冲洗，至
pH恢复到无热源水的pH，将滤器置于烘箱50~60℃烘干，备用）。

3.2.4 记录
详细记录溶解的样品名称、批号、数量、溶解方法、溶解性能、最终体积等。

4 纯化实验
鉴于纯化所用机型、柱、目的等不同，此处只简述主要注意事项：
4.1 谨慎回收
原则上，每次纯化各峰均应回收，清楚标注，置于冰箱备用。

只有当完全确定目的峰已经得到后方可处理。

4.2 小样预备实验
每换一种样品,当色谱柱平衡后,即进行小样预备试验,试验成功后方可正常进样。

4.3 溶液处理方法
进行HPLC的溶液应按要求进行处理。

水、有机溶剂、水/有机溶剂等溶液He气脱气完全（10min左右）。

Buffer/有机溶液，则先
5 合并收集
5.1 即使在纯化条件已经确定的条件下，每次纯化后各峰也只能分开收集，待已确认后方可
合并。

5.2合并时标注清楚样品名称、批号、纯化批次、出峰号、主峰好等，并仔细记录。

6 旋蒸
6.1 为提高生产效率，保证产品质量，纯化后收集液需经过旋转蒸发后才可进行冻干。

6.2 收集各峰后，如当天不进行旋蒸，则置于冰箱内冰冻保存。

如当天旋蒸，置于-4℃保存。

严禁反复冻融。

6.3 旋蒸仪使用参见《旋转蒸发仪操作觃程》
6.3.1 旋蒸瓶须洁净，且经干热灭菌。

所装液量不超过1/3；
6.3.2 如含乙腈等挥发性样品，易爆沸，此时应控制真空度逐渐下降；以150→140→…→8mP
为宜。

或按continus。

运行过程中如发现爆沸应立即停止。

如发现有部分液体爆沸出，立即回收。

6.3.3 旋蒸不宜过浓。

否则样品附壁损失严重。

旋至合适程度后，以移液管转至150ml或以
下觃格的干净烧杯或锥形瓶中，然后加入少量无热源水重新转入旋蒸仪上旋转，使附着的样品溶解。

如此反复3次。

6.3.4 收集液瓶口须以Pilifilm膜封口，并加锡箔。

做好标签。

-35℃冰冻保存。

7 冻干
7.1 冻干瓶以容量为150ml的锥形瓶或烧杯为宜。

7.2 对于Lyo-0.4，样品必须完全冻干后方可抽干。

抽干过程中应经常注意观察，如发现已融
化，应立即取出再次冻实后方可继续抽干。

7.3 冻干时，瓶口以Pilifilm膜或锡箔封口，需在其上以针戳大量小孔。

冻干完毕后，应立即
以完全的膜或锡箔紧密封口，置冰箱保存。

7.4 冻干结束时，应缓慢放气。

压力下降过快将导致样品散出。

8 保存
8.1 合成的粗肽置于-35℃低温冰箱；
8.2 已溶解的粗肽样品，如当日取用，置于-4℃备用，不可放置在常温环境；如第二日取用，
则冰冻保存；
8.3 已纯化或脱盐的样品，如无须合并，立即-35℃冻干；如需合并，则置于-4℃备用，待合
并后一同冻干。

8.4 最终收集样品，分段收集后，再分类合并，旋蒸后置-35℃保存。

8.5 冻干样品严密封口后，置于-35℃保存。

9 鉴定
9.1 每批样品纯化脱盐后，分段收集，并进行HPLC纯度检测。

纯度检测报告必须备档保存。

9.2 对于需报送质谱的样品，由纯化人员自行标注清楚样品名称，交至负责人员统一外寄。

结果应交由资料员备案。

9.3 送打质谱的样品无需完全抽干。

某些对盐含量有要求的质谱，需进行脱盐。

10 样品的留存
经检测合格的样品,特别是售出样品,均应有留存,用西林瓶装好封口,贴上标签,标签上应写明样品名称、批号、数量、纯化日期等。

11 其它说明
11.1 命名按《技术部产品批号编制》严格执行。

11.2 严格标注标签。

进行抽干的玻璃器皿，必须标注瓶重。

取用粗肽与精肽时，必须在标签
上注明取用日期与数量（避免盘点统计时的复温损害）。

11.2 第一次领用粗肽时，应视为出库。

需按觃定填写《领料单》，由仓管人员发放。

领用后，
如一次未用尽，则自行按要求保管。

样品直至达最终纯化达目的后，方可入库，需附检测结果（HPLC、MS、质量等），由仓管经办。