2013/05/13
紫外分光光度法测蛋白酶酶活
1、原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2、试剂和溶液
三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。
2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L
称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L
按GB601配制。
2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4 缓冲溶液
a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶
甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。
2.5 10g/L酪素溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
2.6 100ug/mL L－酪氨酸标准溶液
a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸
60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。
此溶液在冰箱内贮存或立即使用。
3 仪器和设备
3.1 恒温水浴40±0.2℃。
3.2 紫外分光光度计应符合GB 9721的规定。
4 分析步骤
4.1 求K值
按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。
4.2 测定
吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。
滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm 比色皿，测定其吸光度（A）。
a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；
b、按下列程序操作：
试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）
加酶液2.00 mL加酶液2.00 mL
40±0.2℃，2min 40±0.2℃，2min
加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）
40±0.2℃，10min（精确计时）40±0.2℃，10min（精确计时）
加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）
继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心
于275nm波长，测上清液吸光值于275nm波长，测上清液吸光值
c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4.2。
标准曲线作同样处理。
5 计算
在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E
式中：X——样品的酶活力，(u/mL)；
A——试样溶液的平均吸光度；
K——吸光常数；
8——反应试剂的总体积，mL；
2——吸取酶液2.00mL；
1/10——反应时间10min，以1min计；
n——稀释倍数
E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77）。
所得结果表示至整数。
6 结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3％。