计算浓度和含量
实验结果
注意事项
1.为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进
行，研磨时间尽量短些
2.注意叶绿素一定要提取干净，避免造成测定误差
3. 叶绿素提取液不能混浊
4.分光光度计转换波长时要重新调零 5.实验过程中使用同一台分光光度计测量
思考题
1、分光光度法与一般的比色法有何异同？ 2、叶绿素a和b在蓝光区也均有最大吸收峰，能 否用这最大吸收峰波长进行叶绿素的定量测定 分析？为什么？
下周实验内容
植物呼吸强度的测定 （瓦氏呼吸计法）
出其浓度
叶绿素a :663nm 处最大吸收峰； 叶绿素b: 645nm 处最大吸收峰； 且两吸收曲线相交于652nm 处
663nm
645nm
蓝紫光区
红光区
类胡萝卜素→吸收兰紫光，不吸收红光等长 波长的光 叶绿素→吸收红光、兰紫光
在测定叶绿素a、叶绿素b时，为了排除类胡
萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿
分光光度计使用方法
1. 开启电源，指示灯亮，仪器预热20分钟。 2. 波长调至测试用波长。 3. 开盖T调0。 （调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”） 4. 放入空白对照液，将光路对准空白对照位置 5. 关盖T调100。 （调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”） 6.调A为0。 （调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”） 7. 将被测样品移入光路，进行测定，显示值即为被测样品的吸 光度值。
实验材料与器材
◇实验材料：青菜 ◇实验器材：50ml容量瓶、小漏斗，5ml移液管一 只，研钵一套，剪刀一把，滤纸，天平，722型 分光光度计 ◇实验试剂：80%丙酮
实验步骤 1
1.鲜叶洗净，吸水纸吸干，称取0.5克（避开主叶
脉）剪碎置于研钵中加少量石英砂和80%丙酮（约 2-3ml）研成匀浆； 2.倒入约20ml 80%丙酮，静置10分钟； 3.将上清液沿玻棒移入过滤的漏斗中（滤纸用80%的 丙酮湿润），滤入50ml容量瓶中； 4.残渣留在研钵里，再用80%丙酮反复提取2-3次， 直至残渣变白无绿色； 5.然后用丙酮液冲洗滤纸变白为止； 6.再用丙酮液定容到刻度，即为叶绿素提取液。
实 验 原 理1
◇根据朗伯-比尔定律 当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与 溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。 ◇即：A = K * L * C K：比吸收系数 L：液层厚度 C：溶质浓度 (克/L)
比吸收系数()的物理意义
Lambert-Beer 定律中的比例系数“K ”的物理意义是：
吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度
素在红光区的最大吸收峰。
叶绿素a和叶绿素 b的80%丙酮溶液， 当浓度在1g/L时， 比吸收系数k值:
波长 （nm） 663 645
K值
叶绿素a
82.04 16.75
叶绿素b
9.27 45.60
663nm 645nm
据此可列出下列方程式：
A663= A叶绿素a + A叶绿素b A663= Ka L Ca + Kb L Cb A663 = 82.04 Ca + 9.27 Cb……………(1) A645 = 16.75 Ca + 45.6 Cb……………(2)
实验步骤 2
◇将上述提取液注入1cm光径的比色皿中 （以80%丙酮液为对照） ◇用分光光度计分别在645nm、663nm、470nm处读取 光密度。
Ca = 12.7A663-2.69A645 Cb = 22.9A645-4.68A663
C类胡萝卜素=(1000A470 – 3.27Ca – 104Cb)/229
A663、A645分别为叶绿素溶液在波长663、645nm处的光密度; Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(单位:克/升)
将上式整理，可以得到下式：
Ca (g/L) = 0.0127A663-0.00269A645 （3） Cb (g/L) = 0.0229A645-0.00468A663 （4）
(单位：mg/L)
实验步骤 3

将读取的光密度A645和A663，计算提取液叶绿素a、b和类胡萝 卜素的浓度或叶绿素的总浓度，然后按下式计算叶绿素类胡 萝卜素在叶片中的含量： 叶绿素含量或类胡萝卜素(鲜重%)=


或：叶绿素含量或类胡萝卜素(毫克/克鲜重)=
实验步骤
叶片洗净、吸干、去大叶脉 ↓ 称0.5g叶,用80%丙酮研磨 ↓ 匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液） ↓ 滤液用80%丙酮定容到50ml ↓ 测A645、A663、A470
将叶绿素的浓度改为mg/L，则上式变为： Ca (mg/L) = 12.7A663-2.69A645 （5） Cb (mg/L) = 22.9A645-4.68A663 （6） －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645 （7） CT为叶绿素的总浓度
比吸收系数()的性质

① κ与溶液的浓度和液层厚度无关，与吸光物质的特性及光 的波长等有关，也受温度和溶剂的影响。
② 对于同一波长下，当其他条件一定时(温度、溶剂等) ，κ 的大小取决于物质的性质。 ③ 对于同一物质，当其他条件一定时(温度、溶剂等) ，κ的 大小取决于波长。 ∴ κ能表示物质对某一波长的光的吸收能力。 κ越大，表明物质对某波长的光吸收能力越强。
实 验 四
叶绿体色素含量的测定 （分光光度法）
实 验 目 的
◇叶片的叶绿素含量直接影响着光合速率，并与氮 素营养有密切的关系，在栽培、生理、农化、育 种等研究上是重要的诊断指标，常需测定和控制 叶绿素含量。 ◇掌握使用分光光度计定量测定叶绿素含量
叶绿素含量测定方法
叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有： 1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间 接计算叶绿素的含量 2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在 最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯-比尔定律计 算出提取液中各色素的含量



实 验 原 理2
吸光度的加和性
◇如果溶液中有数种吸光物质，则此混合
液在某一波长下的总吸光度等于各组分 在相应波长下吸光度的总和 ◇即：A = A1 + A2 +…… + An

叶绿体色素提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素; 只需测定该溶液在三个特定波长下的吸光度;

根据这三个色素在该波长下的吸光系数即可求
பைடு நூலகம்
663nm 645nm
蓝紫光区 470nm
红光区
类胡萝卜素含量的测定

在叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测 定溶液中的类胡萝卜素含量 在80％丙酮提取液中三种色素含量的计算公式 (单位：mg/L)：

C类胡萝卜素=(1000A470 – 3.27Ca – 104Cb)/229
◇由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光 谱有差异，因此，使用其他溶剂提取色 素时，计算公式有所不同