湿热灭菌柜验证实例实例1：湿热灭菌设备的温度验证1温度验证程序设计基本要求湿热灭菌的基本程序设计基本要求源于US.FDA在上世纪70年代中期提出的，且在80年代施行的：“关于大容量注射剂GMP技术性原则”五个方面要求：(1)在灭菌工序应能确保产品达到F0≥ 8；(2)灭菌前，待实验的容器中有最高带菌量，污染菌应具有最强的耐热性；(3)每一个灭菌釜的每种装载方式及每种规格容器的验证实验均至少使用10支热电偶进行热分布实验；(4)用待实验容器灌注粘度相类似的产品进行热穿透实验，找出容器中升温最慢点的位置，至少使用10个容器，每个均加入适当的生物指示剂并且插有热电偶。

当灭菌釜的参数已经达到热分布实验已经证实的可重现状态，温度达到设定的灭菌温度时，开始测定F0 值，直到开始冷却止；(5)当产品达到灭菌温度直到开始冷却的过程，温度变化必须保持在±0.5℃以内。

2温度验证的功能测试步骤由此技术设计要求出发，演化成为目前国内广泛采用的湿热温度验证的大容量注射剂实验方法和实验器具,也是温度验证程序设计的基本要求。

使用其作功能测试步骤及参考设备如下：前提：湿热灭菌设备的安装测试合格，现场和公用工程外接条件完备。

即通常讲（DQ，IQ）已经结束后，位置在OQ运行确认。

2.1热分布测试目的：找出最冷点位置，检验重现性。

步骤：(1)设备仪器校正；(2)热电偶分布图；(3)空载热分布实验，3次以上；(4)热电偶插入图；(5)装载（模拟生产装载最大，最小量）热分布实验，各3次以上。

2.2热穿透测试目的：肯定灭菌过程中被测试各点获得无菌保证值，特别是最冷点位置的F0值,监测检验重现性。

步骤：(1)设备校正；(2)模拟生产灭菌装载；(3)热电偶装载图；(4)同品同规产品最大与最小装载热穿透实验，每状态3次以上。

2.3 生物指示剂测试目的：挑战性模拟生产可能因素造成的微生物污染程度来检验灭菌可靠性，对验证设计进行检验。

步骤：(1)方案的设计制定；(2)生物指示剂菌株的选择，测定D值；(3)标定浓度和制定样品；(4)接种，装载；(5)低限灭菌(每产品，每规格每种灭菌程序至少3次以上）；(6)样品的培养与鉴别；(7)评价结论（数据，样品分析）。

2.4 偏差与调整重新设计后，重复上面步骤。

2.5 填写验证实验报告书3湿热灭菌温度验证对验证仪器的基本要求按前所述温度验证程序设计要求的技术原则的五方面内容，验证设备可包括三部分：(1)测温元件；(2)测温编辑记录仪器；(3)辅助校正仪器。

3.1测温元件测温元件采用敏感的多枝精密铂电阻或电偶组成，原理如图1。

接线较长可以独立的摆放在灭菌设备中选定位置，每支的误差在±0.5℃以下的测试精度范围。

校正时，发生误差越程件应筛选。

这是因为误差越程后在后面的计算中将导致 F0 偏离，容易带来误判结果。

电偶是温度到势能的变换器，而电阻是温度到阻值的变换器，两者在输出的信号上是不同的。

从输出特性灵敏度看精密铂电阻（RTD）为优。

从测温范围上比较（-180~2000℃），价性比上热电偶较优。

所以，经典教科书上和专家针对生产企业设备温度验证仍推荐热电偶。

它是验证的温度信号采集器（精密的多只眼睛）。

目前开发先进的仪器采用无线信号传送作为测温元件。

测温记录仪就近接收发来的每一个信号，自动完成转换和记录、存储，但造价昂贵，特别小气，保管有特别的要求, 目前针对旋转釜国内已有使用。

在灭菌釜的实际温度验证实验仪器上，国内外已经开发和生产出成熟的部件和比较先进的仪器，如GE.Kaye（US）、raytek（US）、Sakura 、multi(Japen) 、Schlumbergez(England) 、 Goodwill(台湾固纬)、Validator2000(北京祥鸿) 等温度验证仪。

3.2测温编辑记录仪器测温记录仪器是整个实验的大脑。

国内外诸多公司直接采用PC机开发，在Windows 系统平台基础上开发自己的多点数据记录、整理、计算、存储及I/O的接口软件，其集多功能软件为一体装配在计算机中，既便携带，又图文齐备，直观可靠。

3.3辅助校正仪器设计为一台高精度的恒温油槽（又称干井，见图2），采用温控PID调节控温精度高，温度波动范围设计在±0.05℃。

其有断偶保护功能，上限设计超温报警功能。

升降温快速、稳定、可靠。

在设定温度和测量温度数字上，分别3又1/2精确显示。

在低温段检校采取冰点槽（低温干井）设施，高低温干井分别检测电偶的特殊点温度值误差和能否用于实验的合格性进行甄别筛选。

它即是本实验的检测校正部件，也是实验室的常备精密温度源。

通常交国家法定技术监督部门定期检校确认合格,在有效期内使用。

4电偶的布置及被灭菌物装载从国内许多温度验证工作开展与企业参观的实践中，专家都肯定被灭菌物装载及电偶的布置对温度验证结论有一定的影响。

集中反映的问题有以下几方面：(1)电偶前端部分不要接触周边介质（被灭菌装载物，笼架，柜壁）。

汽流和高温水流对其冲击不会发生碰撞接触和位移；(2)釜（胆）体喷淋板孔堵塞或加工飞边毛刺将影响水流及安置的设备平行度，也将影响水量分布和流向；(3)预测高温点（蒸汽入口）、低温点（凝结排放或循环水出口）与同步点（电偶位置与本柜设计检测探头处相同位置）的接线、编号与摆放方式有误。

装载物（模拟灭菌生产类似物）的摆放模拟方式越接近实际生产，和影响热传递的模拟产品的液体粘度越接近灭菌药品粘度，摆放的电偶数量（10<N<20）越多越均匀，那么实验的可信度越大，真实误差越小，越逼真。

< DIV>在2.4(3)所涉及点外，其余点选择视设备有所不同。

如喷淋式灭菌柜，过热水是由上至下流动传递热量，验证技师强调堆码底层和堆码中心是考核重点，建议摆放在底层均布为重；又如SVP脉动灭菌釜，则强调堆码底层接近排气口周围的布置是考核重点；再如喷淋旋转式灭菌柜，过热水是由外至里流动传递热量，验证技师强调中剖面四角和中心是考核重点，建议摆放呈轴向中部层为重。

而某些专家特别研究后，提出仍以可靠性和准确性为布置意图的核心思想。

然而，需要对不同釜形作具体分析和实验注重均布性，取弱点代表。

值得注意的是在设定灭菌程序一定（如121 ℃/15分，115℃/35分等）后，温度实验验证采取的实验设计参数，其装载方式和生产灭菌的正常采用方式是相同的、固定的，否则会造成检测偏差。

特别强求的是，模拟生产现场条件的相似性和一致性是相当重要的条件因素。

实际的LVP设备均为多笼车和大产量（有上万瓶/柜）的高效型。

对冷点与次冷点的检测和判断必须是多次数据的综合结论。

然而，使用过程存在冷点、次冷的漂移和改变属再验证确认。

高温点的控制判断也是必须监测的参数，这将涉及到药品的高温药效评价。

探头不足的情况下，可以固定装载形式后，经单笼车多次测试与对比，步步逼近搜寻冷点、次冷点、高温点等参数。

同时，应和实际的生产装载形式一致，不得改变装载形式以保证应用偏差的最小化和数据的准确性。

当然，按照生产现场的模拟情况步骤上应有最小装量和最大装量，每品每规至少3次（如设备太大，探头不够而分段测试，则数据将更多），至少3组稳定数据来考核设备的重现性和筛选热分布参数的准确性。

加上校正、布置、辅助装载、检测、纪录分析等是验证班技工好几周的工作量。

可见，试验的艰苦和细致要求，如此劳神费力是因为它的准确性对后面工作有十分重要的指导性意义。

5热穿透试验及标准灭菌时间F0热量在物理学中有传导、对流和辐射三种基本传递形式，其综合产生了强大的热穿透效果，人们关心的是热穿透效果，故取名为热穿透试验。

早些书籍上有称它为带产品负荷的热分布试验，目前仍然以热穿透试验的称谓居多。

目的是为了用前述实验的极值点来考核其F0值，对已经灭菌的产品是否被赋予设计的灭菌保证值进行具体数据检测考核。

本实验的步骤和方法与装载和前述的热分布试验大体相同，差别在于温度探头的布置是插在产品中，不接触药品容器周边和底部。

摆放在下列位置，并一一对应作好编号：(1)热分布试验确定的最冷点和次冷点；(2)热分布试验确定的最热点和次热点；(3)和灭菌柜温度控制设计探头并列（又称同步点）；(4)纪录腔室温度探头（不插入产品中），其余和热分布位置相当，均匀布置。

每点的温度纪录后按照时间间隔（30秒或1分）详细纪录打印，并计算每点从升温到降温过程中100℃上的F0值、各点总的F0均值、最大与最小值关键数据。

探头使用前后都要在冰点槽和油浴槽中仔细的校正，剔除超差件。

在保证重现性非常好的情况下，稳定试验数据不得低于3组。

也就是本试验在某品种规格和对应某装载固定不变的工况下至少需稳定状态下作3次实验。

可接受的标准是：(1)灭菌设计程序下各点热穿透试验获得的F0值基本一致；(2)最冷点F0值和产品的F0 均值之间差值小于2.5(参数的参考解释见《药品生产验证指南》1996版，221)；(3)整体的F0值监察分析，其没有在设计的F0值允许波动的公差上下限外数据；(4)具备良好的重现性，连续三次以上重现性）。

以F0值作为监察分析的历史由来已久，从经典的资料查阅可以找到，湿热灭菌中微生物杀灭的对数规则始于1921年Bigeow和Rahn等科学家的研究。

他们论文的主要成果是：灭菌时微生物死亡遵循对数规则，过程可以用阿仑乌斯（Arrhenius）的一级反应式来描述。

根据质量作用定律，在恒定温度及保持其它条件不改变的情况下，单位时间内被杀灭的微生物数正比于初始的原有数目，可以表示为以下的线性式：dN/dt = K (N o-N k ) (1)整理后lg N t = lg N o– ( K/2.303) t取其斜率的负倒数定义为D值，D= 2.303/K= t/ (lg N o - lg N t )，取(lg N o - lg N t )=1，D= t，则为微生物被杀灭90%的时间。

也称谓微生物九成杀灭时间,单位为分，D为正值。

在USP中，D值则表示灭菌的程度。

D值区分不同的微生物，在不同的温度和介质情况下数值不同，具体的数据是可以查阅的，其值越大表明微生物越难杀灭。

随着灭菌温度升高，杀灭耗用的时间越短。

试验在（100~138℃）范围lg D与温度有线性关系，取其斜率的付倒数定义为Z值：Z = （T2 – T1）/ lgD 1- lg D2 ---------------（2）Z值代表微生物被杀灭减低一个lg D数量单位所需升高的温度数值,代表微生物对热敏感系数，其值越大对热越不敏感。

单位为℃ ，Z 为正值。

实验选取强耐热菌株（嗜热脂肪杆菌B.Stearothermophilus）为代表的Z值在多种介质中为9.4 ，考虑Z值选取10，从安全角度既留有安全余地且对数计算应用上十分简便。