真菌漆酶的研究进展宋瑞（安徽大学生命科学学院合肥230039）【摘要】漆酶是一种蓝色多铜氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶，哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属同族，能够催化多种有机底物和无机底物的氧化[1,2]，同时伴随分子氧还原成水。

漆酶广泛分布于真菌、高等植物、少量细菌和昆虫中，尤其在白腐真菌中普遍存在。

漆酶特有的结构性质和作用机理使其具有巨大的应用价值。

本文就真菌漆酶结构，功能的研究进展作一综述，并对其应用作简单介绍。

【关键词】真菌漆酶三维结构功能应用1真菌漆酶结构特征1.1 漆酶的组成漆酶是一种糖蛋白，肽链一般约由500个氨基酸组成[3]，糖基含量差异较大，占整个分子质量的10%—80%[4]，据相关报道，漆酶的热稳定性可能与其糖基化有关。

糖组成包括半乳糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、氨基己糖和阿拉伯糖等。

Mayer[5]认为漆酶并不均一，它由多条5000~7000分子量的糖肽链基本结构单元组成。

由于结构单元之间的缔合度不同，造成了各种漆酶分子量的不同。

另外，分子中的糖基的差异，也会引起漆酶的分子量随来源不同会有很大的差异，从59—390ku不等。

真菌漆酶约含19种氨基酸，绝大部分为单体酶，但也有例外，如双孢蘑菇和长绒毛栓菌漆酶由两个亚基组成[6]，而柄孢壳漆酶I由四个亚基组成。

漆酶种类繁多，不同种类的真菌产生的漆酶种类不同，即使同一种真菌在不同环境下也产生不同种漆酶。

1.2漆酶的晶体结构由于漆酶是含糖蛋白质，且糖质量分数较高，一直以来很难获得X-衍射分析所用的单晶体，因此阻碍了关于漆酶结构的研究进展。

1998年第一个漆酶晶体是Ducros V[7]制备的来自灰盖鬼伞(Coprinus cinereusv)T1Cu缺失型漆酶晶体，并分析了其结构。

至今为止，Bacillus subtilis(CoA)[8]；Melanocarpus albomyces(MaL)[9]；Rigidoporus lignosus(RiL)[10]；Pycnoporus cinnabaricus(PcL)[11]；Coprinus cinereus(CcL)[12]和Trametes versicolor(TvL)[13]漆酶的三维结构已相继被报道。

漆酶分子整体由3个杯状结构域所组成，分别称作结构域A、B、C，每个结构域主要由β-折叠桶，α-螺旋，loop结构所组成。

三者紧密结合形成球状结构。

这是铜蓝蛋白家族所共有的结构形式[7,9]。

分子当中含有二硫键，漆酶种类不同，二硫键数目也不一样，MaL 漆酶分子由3个二硫键，分别是位于结构域A Cys4～Cys12、结构域A和C界面上Cys114～Cys540、结构域C Cys298～Cys332，而CcL，RiL漆酶中则含有两个二硫键。

在CcL漆酶分子中，由结构域A的Cys85和结构域B的Cys487形成一个二硫键，另一个二硫键存在于结构域A和结构域B(Cys117—Cys204)之间。

一个伸展的loop(氨基酸284—327)连接结构域B和结构域C。

Asn343上有N连接的N—乙酰葡萄胺。

1.3 漆酶的催化中心真菌漆酶分子中一般都含有4个Cu原子，根据磁学和光谱学性质不同可将4个Cu原子分为三类：Ⅰ型Cu2+(T1Cu)和Ⅱ型Cu2+(T2Cu)各一个，都是单电子受体，呈顺磁性；Ⅲ型Cu24+(T3Cu)两个，是耦合离子对，是双电子受体，反磁性[14]。

T1Cu位于结构域C上，T2Cu 和T3Cu位于结构域A和C的界面上。

漆酶绝大多数都只含4个Cu 原子，Karhunen E等[15]研究的射脉菌( Phlebia radiata)漆酶却只含有2个Cu原子(T1Cu、T2Cu各一个)，无T3Cu原子，但该漆酶分子中含有1个具有类似T3Cu功能的有机小分子辅基吡咯喹啉(pyrroloquinolinequinone，PQQ)。

Palmieri G等[16]从糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)中纯化的一种新型漆酶POXA1中含有1个Cu原子，2个Zn原子和1个Fe原子，由于缺少T1Cu，在610nm处没有吸收峰，酶蛋白呈白色。

在不同种真菌漆酶分子中，与Cu原子相连的1个Cys 和10个His及其周围的氨基酸配基则是相对保守的，这些氨基酸都分布在含有两对His的N末端区域，或是分布于C末端的Cys和其余结合铜原子的His之间。

Cu离子构成了漆酶的活性中心，在漆酶催化氧化过程中起决定性作用，如果除去Cu离子，漆酶将失去催化功能。

1.3a T1Cu结合位点T1Cu形成单核中心接受来自底物的电子转移，具有典型的蓝铜谱带，紫外可见光谱上600nm处有吸收峰，它是底物反应场所，把来自底物的电子传递三核中心铜原子上。

T1Cu以Cu2+形式存在，在所有的漆酶中都与两个His的N原子和一个Cys的S原子配位结合，形成扭曲的四面体结构。

有些多铜氧化酶还有第四个轴向的氨基酸配基，在不同的多铜氧化酶中配基种类不同，在抗坏血酸氧化酶中为Met，大多数其它真菌漆酶中通常为Phe，而灰盖鬼伞漆酶中为Leu，距离T1Cu 3.51Å，因此不能成为T1Cu的配基。

这种配位的不同被认为可能引起真菌漆酶氧化还原电位升高。

Perrycr等[17]认为此位置的还原电势强弱与其疏水基团大小成正比，如为甲硫氨酸(Met)配基，亮氨酸(Leu)配基，苯丙氨酸(Phe)配基，其还原电势依次升高。

然而Silvia Garavaglia等[10]通过比较CcL(低Eo)和TvL(高Eo)的不同发现，Leu或Phe不同的配位并不是导致氧化还原电位变化的最主要因素，认为T1Cu-NE间的距离则是影响氧化还原电位高低的主导因素。

围绕在T1Cu一侧的是一个疏水性口袋，Leu462两边分别为Phe340和Phe398。

T1Cu存在于Ile454的一侧，且位于一个约12Å宽、6Å深的凹陷中，结构域A和结构域C的三个loop构成了凹陷的表面。

这个区域与还原底物的结合有关。

这些伸展的loop区，决定了底物特异性，而真菌漆酶具有极度广泛的底物专一性，这可能是由于漆酶中缺少这些区域，序列变异性也较大，且结合位点相对较大，再加上loop 构象上存在的变化(表现在室温和100K结构之间的不同)的影响。

1.3b T2/T3Cu结合位点T2Cu与T3Cu形成三核中心接受来自T1Cu单核位点的电子，与高度保守的四个His-X-His花样的8个His配位结合，T2Cu结合2个，每个T3Cu结合3个[8,10]。

两个T3Cu之间结合漆酶的第二个底物氧分子。

T2Cu具有电子顺磁共振效应，不易结合弱的配体，且不稳定，当螯合剂存在时，能够被一些2型耗竭(T2D)衍生物选择性还原去除；T3Cu的两个铜原子间偶联，其EPR性质消失，由于电子在OH和两个T3Cu之间的传递，在330nm处有特征吸收带。

另外，在400～460nm间有一些小吸收带，推测是一些反应中间体，如氧/过氧中间体(PI)[18,19，20]。

T2Cu与2个His和一个水分子或一个氯原子配位，形成T型几何结构[21]，这种结构对一价铜比二价铜更有利。

在灰盖鬼伞漆酶晶体结构中，由于去除糖链导致T2Cu缺失，与抗坏血酸氧化酶相比，其构象发生些许变化。

T3Cu对的两个Cu原子相距为5.3Å，而后者只有3.7Å；含氧的配基只结合T3Cu原子对中的一个，而且它在两个Cu原子间是不对称排列的，相距Cu3(a)和Cu3(b)分别为2.17Å和3.26Å；另外与其相似的是T2D漆酶（T2Cu 被螯合，T1Cu和T3Cu保持完整），在T2D漆酶中，与T2Cu配位的His399的咪唑环发生了旋转，因而能与T3Cu原子对中的一个Cu（距离2.5Å）配位；His399存在构象柔性，在1.68Å，100K结构中有两种构象，一种与抗坏血酸氧化酶和血浆铜蓝蛋白中的构象相对应，另一种是与T3Cu(a)配位的新位置。

在100K时，两种构象比例为60:40，而在2.2Å室温结构中比例为80:20。

总之，T3Cu(b)与His109、His66、His453配位，形成一个轻微扭曲的三角平面，距离氧桥3.26Å，距离T3Cu(a)5.1Å。

T3Cu(a)有两种配位状态，一种是与His451、His111、His401的N和氧桥配位，距离分别为1.98、2.01、2.04和2.17Å，犹如一个扭曲的四面体。

另一种是Cu3(a)与旋转进入配位区的His399形成第五个配位，距离2.5Å。

因此，T2D漆酶有两种构象，其平衡受温度变化和结晶条件的影响。

不同来源漆酶的T2/T3Cu结合位点也有所差异，在Rigidoporus lignosus(RiL)中T3Cu的2个铜原子间无OH桥存在，相反T2Cu，T3Cu(a)则分别与1个OH相连，但由于与OH是不对称相连，所以不能认为是OH桥。

然而，Bacillus subtilis(CoA)T3Cu的2个铜原子则是通过1个OH桥配位连接起来，组成双核铜区，具有抗磁性，因而在EPR上无信号产生。

Silvia Garavaglia等[10]认为在Rigidoporus lignosus(RiL)中，T3Cu(a)、T2Cu分别与1个OH相连是导致EPR沉默的原因，具有EPR活性的是与来自3个His的N原子相连的T3Cu(b)，而不是T2Cu。

T2和T3中心紧密相连形成一个三核中心，其结合方式可能有以下三种模式：(1)三个同原子族是通过羟基和/或过氧基桥链连接，早期的报道均持这种观点；(2)通过双氧（过氧）连接，两个氧原子到三个铜原子的距离几乎一样，均在2.4～2.6Å之间，同两个T3Cu呈（扭曲）四面体，同T2Cu呈平面四方构型，Hakulinen等的分离态[22]和重组态[23]以及Bento等[24]的CuCl2浸泡态结构支持这种模型，(3)三个铜都同一个µ3-氧连接，另一个氧原子已经转变成水离去[25]，这可能是反应过程中的一种状态。

1.3c 活性中心结合方式T1Cu距离三核中心约为1.25nm，通过T1Cu-Cys-His-三核中心联系起来，形成电子传递通道。

Leif J[26]等人研究T. versicolor活性中心时发现其含有2个二硫桥：Cys117与Cys205形成一个二硫桥，把T1Cu 区和T2Cu区联系起来；Cys85与Cys487形成另一个二硫桥，把T1Cu区与T3Cu区联系起来。

从空间结构上看，T1Cu可能距离两个T3Cu 约13Å[27]，而T2Cu到两个T3Cu的距离可能略微不等，T3Cu原子对间的距离约为 4.8Å。