一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法王大威;张健;姜伟;张凤久【摘要】脂肽(Lipopeptide)是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物产生的一类具有较强表面活性的生物表面活性剂.枯革杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(afp)是枯草芽孢杆菌中参与脂肽代谢的功能性基因.采用sfp基因PCR对从环境中得到的一组产生表面活性剂的微生物进行筛选,结合Tricine-SDS-PAGE电泳对PCR结果呈阳性的菌蛛的代谢粗初提物进行检测,初步鉴定得到两株枯草芽孢杆菌.进一步利用16S rDNA序列的系统发育学分析确定这两种菌株为枯草芽孢杆菌,并利用TLC、HPLC鉴定其产物为脂肽类表面活性剂,从而建立了一套快速分离检测产生脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌方法.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】5页(P142-146)【关键词】脂肽;枯草芽孢杆菌;sfp基因;Tricine-SDS-PAGE;电泳【作者】王大威;张健;姜伟;张凤久【作者单位】中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中国海洋石油总公司,北京100027;中国海洋石油有限公司,北京100027【正文语种】中文脂肽(Lipopeptide)又名脂酰肽(Acylpeptide)，是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成的小肽，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂显示了十分优良的特性，在医药、食品、化妆品、环境治理和微生物采油等领域都有广泛的应用[1] 。
大多数脂肽来源于微生物，而其中以来源于细菌的脂肽居多。
目前发现的脂肽类生物表面活性剂有10余种，主要包括Surfactin、Lichenysin、Iturin和Fengysin等[2] 。
其中表面活性素(Surfactin)是一类环状结构的脂肽(图1)，具有良好的表面活性，能增加憎水烃类的生物可获得性，激发烃的生物降解，与部分重金属结合能移除被污染的土壤和沉积物中的重金属;同时，还具有特殊的生物活性，能提高尿激酶的活性，防止血液凝结。
脂肽类生物表面活性剂发现35年来，尽管相比于化学合成表面活性剂，其具有诸多优点，但目前脂肽类表面活性剂的应用还十分有限。
这主要是因为发现的产生脂肽的菌株较少，公开报道只有20株菌株可以产生脂肽[3] 。
近年来，人们一直采用血平板法和扩油圈法筛选产生物表面活性剂的菌株，这些方法不仅工作效率低，且不能有效将产脂肽的微生物从中区分开;同时鉴定微生物产生的脂肽的方法一般都采用高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)、质谱对纯化的产物进行分析，这些检测手段对产物的纯度要求较高，但脂肽类生物表面活性剂纯化需要经过酸化沉淀、冷冻干燥、真空抽干等繁琐的工序，费时而且效率低，因此如何快速筛选产生脂肽类表活剂的微生物一直是困扰研究人员的主要问题。
枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(sfp)位于srf操纵子的下游(图2)，片段长4 kb，是参与脂肽代谢的第二调控元件。
Nakano等[4] 确定了sfp基因的核酸序列，其编码枯草杆菌磷酸泛酰巯基转移酶(SFP)属于 4-phosphopantetheinyl transferase超家族。
Hsieh等[5] 曾报道针对sfp基因合成引物，建立快速鉴定产脂肽的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的方法，但该方法后期同样采用传统的HPLC(高效液相色谱)对菌株产物进行分析，在产物纯化时还是会消耗大量的时间和人力。
考虑到采用常规方法分离纯化微生物产生的脂肽存在的诸多困难，本研究拟采用以往蛋白质分离常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法对代谢产物进行分析。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法是分离蛋白质的常用生化方法，该方法简便、快速、价廉、不需要对蛋白或肽类进行过多处理，并具有相对较高的分辨率，但由于Bacillus属细菌所合成脂肽的相对分子量多在1 kD左右，为避免SDS微团对蛋白质分离产生干扰，本研究采用80年代末由Schagger和von Jagow首创的三羟甲基氨基甘氨酸Tris-tricine缓冲系统[6] 对脂肽进行分析。
该系统可使小蛋白质-SDS复合物与SDS微团分离，去除干扰，最小可分离1－10 kb的蛋白质，10多年来，一直利用这种较简便的不连续梯度胶分离小分子肽。
本试验采用sfp基因PCR结合Tricine-SDSPAGE电泳拟建立一套快速分离检测枯草芽孢杆菌及其产物脂肽的方法，减少在菌株分离和产物纯化过程中的对人力和时间的浪费，加快分离目标菌株的进程，为今后现场筛选脂肽类表面活性剂产生菌株提供可靠的方法。
1.1.1 菌株 10株现场分离的产生生物表面活性剂的未知菌株，标准菌株为本实验室保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZW-3。
1.1.2 培养基液体培养基用基本无机盐培养基：K2HPO4·3H2O 4.8 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7 H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.2 mg，三水合柠檬酸钠0.5 g，酵母浸出物0.1 g，氮源为1 g硫酸铵，葡萄糖为碳源，加水配成1 L溶液。
固体培养基另加2%的琼脂，121℃灭菌20 min。
1.1.3 标准品脂肽标准品购自于Fluka(Sigma)。
1.2.1 sfp基因的PCR扩增将初筛的菌株接种于摇瓶培养基中180 r/min 37℃振荡培养3 d。
基因组 DNA的提取参考分子克隆实验指南(第3版)[7] 。
sfp基因的PCR扩增方法参考文献[5] 。
提取细菌基因组DNA，以其为模板PCR扩增sfp基因。
引物f(5'-ATGAAGATTTACGGAATTTA-3')和r(5'-TTATAAAAGCTCTTCGTA-3')由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR体系采用20 μL，反应体系：10×PCR 缓冲液(含MgCl220 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，10 μmol/L 引物各1 μL，DNA 模板1 μL，去离子水13.8 μL。
PCR扩增程序：94℃ 10 min;94℃ 1 min，46℃ 30 s，72℃ 1 min。
共25个循环;72℃ 10 min。
PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳进行检测。
1.2.2 Tris-tricine缓冲系统丙烯酰胺凝胶电泳参照文献[8] ，将PCR阳性菌株接种于摇瓶培养基中180 r/min 37℃振荡培养3 d，发酵液8 000 r/min离心10 min，弃菌体沉淀。
制胶方法与普通Tris-Gly系统相同，注意电泳槽内分别加入阴极和阳极电泳缓冲液，将上清液和Surfactin脂肽标准品溶液(400 μg/mL)上样后，先在30 V恒压下电泳1 h，然后在150 V恒压下电泳4 h，溴酚蓝前沿即可移动到离底部约0.5－1 cm，停止电泳，凝胶小心取下后，浸入染色液中染色，而后脱色、保存。
电泳后，凝胶首先经考马斯亮蓝G-250染色液初染，再使用油红O进行了第二次染色，油红O为脂溶性染料，用于脂类染色。
1.2.3 16S rDNA基因的序列分析为最终确定PCR扩增呈阳性及产物经Tricine-SDS-PAGE电泳为脂肽的目标菌株的种属，对其进行16S rDNA基因的序列分析。
以细菌基因组DNA为模板，扩增引物采用细菌通用引物B14926(5'-CCGGATCCAGAGTTTGATCCTGGTCAGA-ACGAACGCT-3')和B14927(5'-CGGGATCCTACGCCTACCTTGTTACG ACTTCACCC-3')(上海生工生物技术有限公司合成)。
PCR反应体系选用20 μL反应体系：10×PCR缓冲液(含 MgCl220 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，10 μmol/L 引物各1 μL，DNA 模板 1 μL，去离子水13.8 μL。
PCR扩增程序：94℃ 10 min;94℃45 s，55℃ 60 s，72℃ 70 s，共 30 个循环;72℃ 10 min。
扩增的PCR产物连接到载体pMD18-T(TaKa-Ra)上，转化E.coli DH5α。
提取有16S rDNA插入的质粒并测序，序列测定由北京三博远志公司完成。
1.2.4 脂肽薄层层析(TLC)鉴定脂肽薄层层析方法参照文献[9] ，将分离得到的表面活性剂样品溶解在二氯甲烷中配成溶液。
取两块活化的薄板，记为A板、B板，每块板分别点样，在氯仿∶乙酸=8∶2(V/V)中展开10 min。
挥发掉溶剂后，A板直接以茚三酮试剂(0.15%的茚三酮丙酮溶液)显色。
把B板放入耐高温的密封瓶内，瓶中预先以小杯盛约1 mL浓盐酸，110℃烘箱中熏蒸1 h进行原位酸水解，通风橱中冷却，吹去盐酸后，以茚三酮试剂显色。
1.2.5 脂肽高效液相色谱(HPLC)鉴定为进一步验证Tricine-SDS-PAGE电泳的有效性和稳定性，对脂肽表面活性剂进行纯化。
纯化样品采用高效液相色谱进行检测，流动相 A(40%乙腈 +60%10 mmol/L醋酸铵，pH6.9)，流动相 B(乙腈)，进行梯度洗脱，0－10 min内B相由10%变到25%，流动相1.0 mL/min、反相C18柱、紫外215 nm检测即可。
sfp基因PCR产物电泳(图3)显示10株生物表面活性剂代谢菌株中，ZW-4、ZW-8在675 bp处有条带，与正对照菌株一致，可以初步判定为枯草芽孢杆菌。
对细菌发酵液离心上清电泳后，凝胶首先经考马斯亮蓝G-250染色液初染，发现发酵液最前沿条带呈浅蓝色，其迁移距离与Surfactin脂肽标准品相同。
为了进一步确认该条带为脂肽，经油红O染色后，原本呈浅蓝色的最前沿条带和Surfactin 脂肽都被染成红色，可确定该条带为脂肽，电泳结果如图4所示。
染色体DNA用PCR扩增出单一条带，PCR产物回收纯化后，经DNA测序，序列长度为1 426 bp，与GenBank中现有的菌种的16S rRNA基因序列比对，进一步确定 ZW4、ZW8菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，与sfp基因PCR结果、Tris-tricine凝胶电泳结果吻合。
将纯化脂肽进行薄层层析，使用氯仿/乙酸为展开剂，以Surfactin标准样为对照，层析结果如图5所示，样品与Surfactin相当，并且只呈现1个斑点，证明样品被纯化，菌株代谢产物为脂肽(Surfactin)。