Pyrosequencing技术的原理Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。

其基本原理如下：第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。

第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。

第2步图示(图片来自互联网)第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。

通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。

第3步图示(图片来自互联网)第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。

第4步图示(图片来自互联网)第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

第4步图示(图片来自互联网)Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。

→如果您认为本词条还有待完善，请编辑词条上一篇SNP（单核苷酸多态性）下一篇阅读质粒图谱具体事例【摘要】建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称“SRPP”)。

先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签，PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。

用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量，并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。

【关键词】序列标记反转录, 聚合物链反应，焦磷酸测序，基因表达1 引言差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。

目前，用于检测基因表达水平的技术主要有SAGE法[1]、实时荧光定量PCR法[2,3]和基因芯片法[4]等。

但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等缺点。

焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5～8]，不需要使用荧光标记，定量性能好。

目前，焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微生物分型和基因甲基化分析等。

本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析，考察了其可行性和准确性，并将其应用于检测Egr1基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的差异表达。

2 实验部分仪器、试剂与材料21R型台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司);Gene SpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日本Naka Instrument公司);PTC225 PCR扩增仪、Opticon实时荧光PCR仪(美国MJ Research 公司)。

焦磷酸测序装置由本实验室自行组装[9,10]。

此装置主要由焦磷酸测序反应模块、荧光信号放大和数据采集3部分组成。

反应模块由位于中间的反应池通过毛细管与四周的dNTP储液池相连组成。

通过注射器施压使4种dNTP循环加入反应池完成测序反应。

荧光信号通过R6335光电倍增管(日本Hamamatsu Photonics .公司)放大后，经BPCL微弱发光测量仪(北京中国科学院生物物理研究所)采集数据。

Hotstar Taq DNA聚合酶、Omniscript RT kit反转录试剂盒(德国Qiagen公司);Trizol(上海Inviotrogen公司);荧光素、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和5′磷酸化硫酸腺苷(美国Sigma公司); Dynabeads M280链霉亲和素磁珠(挪威Dynal AS公司); Klenow DNA 聚合酶(美国Promega公司);所有引物均由上海Invitrogen公司合成。

实验中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝组织由南京师范大学生命科学学院提供。

RNA的提取用Trizol试剂盒抽提RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度及纯度。

反转录合成cDNA第一链取等量的不同来源的总RNA，分别以来源特异性反转录引物反转录。

即取总RNA ～μg 至Nuclease free的小管中，加DEPC H2O至12 μL;65 ℃反应5 min后，置冰上至少1 min;在上述各小管中加入10×第一链合成缓冲液2 μL， mmol/L dNTP混合物，10 U RNase 抑制剂，200 U Omniscript Reverse Transcriptase，1 μmol/L反转录引物，加DEPC H2O 至总体积为20 μL。

反转录条件为：37 ℃反应1 h, 93 ℃反应5 min，然后中止反应。

基因特异性PCR不同来源的cDNA等比例混合，以共用引物CP(5′CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC3′)和生物素标记的基因特异性引物(GSP)进行扩增反应。

PCR体系为： cDNA等比例混合液1 μL，μmol/L CP和GSP， mmol/L Mg2+， mmol/L dNTP 混合物，10×PCR 缓冲液 5 μL，5×Q 溶液10 μL ， 1 U HotStar Taq DNA聚合酶，并加入灭菌蒸馏水至50 μL。

PCR反应程序为： 94 ℃变性 15 min，热循环35次(94 ℃, 40 s; 60 ℃, 40 s; 72 ℃, 1 min )，72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。

基因特异性引物的序列见表1。

表1 实验用引物焦磷酸测序固相单链模板的制备取5 μL戴诺磁珠(Dynabeads)，用磁铁吸弃上清液。

磁珠以100 μL B&W Buffer(10 mmol/L Tris HCl, pH , 1 mmol/L EDTA, mol/L NaCl)洗涤两遍，最终悬浮于50 μL B&W 缓冲液中;加入50 μL PCR产物，37 ℃反应30 min;用磁铁吸弃上清液，磁珠以180 μL H2O 洗涤两遍，加入 mol/L NaOH溶液20 μL，混匀室温放置5 min使PCR产物变性;磁铁吸弃上清液，磁珠以100 μL B&W 缓冲液洗涤两遍，100 μL 1×退火缓冲液洗一遍，最终溶于8 μL 1×退火缓冲液中;加入1 μL 10 μmol/L测序引物，93 ℃混匀30 s，55 ℃退火3 min，4 ℃保存，待测序用。

焦磷酸测序反应焦磷酸测序标准混合液的组成为： mol/L Tris Ac缓冲液(pH ，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L Mg(Ac)2，% BSA，1 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，3 μmol/L 5′磷酸化硫酸腺苷(adenosine5′phosphosulfate，APS)，μg/L PVP， mmol/L D虫荧光素，2×10-4 U/L 三磷酸腺苷硫酸化酶，2×10-3 U/L 三磷酸腺苷双磷酸酶，18×10-3 U/L无外切酶活性的Klenow DNA聚合酶， mg/L荧光素酶。

3 结果与讨论方法原理焦测序技术是一种基于化学发光反应定量测定引物延伸副产物焦磷酸盐(PPi)的测序技术。

其原理是：引物与模板DNA退火后, 在DNA 聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)的协同作用下完成循环测序反应。

当加入的dNTP与模板互补时，DNA模板与互补的dNTP聚合可以产生等摩尔PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi与5′磷酸化硫酸腺苷(APS)反应生成等量的ATP;在荧光素酶催化作用下，ATP与虫荧光素(luciferin)反应发出荧光。

产生的荧光信号强度与聚合的测序模板量和碱基数成正比，根据加入的dNTP类型和测得的荧光信号强度就可实时记录模板DNA 的核苷酸序列。

反应方程式如下：(DNA)n+dNTPpolymerase(DNA)n+l+PPi(1)PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO2-4(2)ATP+Luciferin+O2luciferaseAMP+PPi+Oxyluciferin+CO2+hv(3)dNTPApyrasedNDP+PiApyrasedNMP+Pi(4)ATPApyraseADP+PiApyraseAMP+Pi(5)为了定量测定基因表达量差异，本研究将碱基序列标记法与焦磷酸测序解码技术相结合，其关键点在于：在不同来源的同一基因中标记上区别样品来源的特异性标签;对标记序列进行解码和定量测定。

采用反转录引物将来源特异性碱基标记到各来源待测基因，然后用焦磷酸测序定量测定标记序列。

具体测定过程如图1所示：(1) 用来源特异性反转录引物对不同来源的RNA进行反转录。

引物由4部分组成：5′端为共用序列;位于引物中间的4个碱基为人为设计的来源特异性标签，在图1中以深浅不同的4个小圆点表示;3′端为oligo(dT)n和用于固定oligo(dT)n位置的两个兼并碱基。

来源特异性反转录引物的碱基组成和数目都相同，只是位于中间的来源特异性碱基的排列位置有所差异;(2) 不同来源的cDNA稀释后等比例混合;(3) 用生物素标记的基因特异性引物和共用引物扩增上述混合物，通过改变基因特异性引物就可以进行任何基因的表达量差异分析;(4) 用磁性微球技术将PCR产物制备成单链，根据来源特异性反转录引物中来源标签序列进行焦磷酸测序。

测序结果中，各来源特异性碱基的相对峰高即代表相对基因表达量差异。

本方法称之为SRPP法(Sequence tagged reverse transcription PCR with pyrosequencing)。

图1 碱基序列标记法结合焦磷酸测序解码技术测定基因表达量差异的原理图Principle of comparative gene expression analysis by coupling sequence tagged reverse transcription polymerase chain reaction(PCR) with pyrosequencing (SRPP)由于不同来源的同一基因在单管中只用一对引物进行PCR，并且扩增产物的碱基组成和含量完全一样，仅4个碱基的排列顺序不一样，具有相同的保留时间。