Vol．31高等学校化学学报No．12 2010年12月CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES2354 2359羧基化氧化石墨烯的血液相容性徐东1，2，周宁琳1，2，3，沈健1，2，3（1．南京师范大学化学与材料科学学院，江苏省生物医药功能材料工程研究中心，2．江苏省生物功能材料重点实验室，南京210097；3．南京大学江苏省表面与界面工程技术研究中心，南京210093）摘要采用超声法制备了氧化石墨烯，并利用化学改性的方法，将氧化石墨烯表面的羟基和环氧基转变为羧基．在红外光谱中羧基化氧化石墨烯（GeneO-COOH）的羧基振动明显，峰强增大．静态水接触角测试结果表明，羧基化氧化石墨烯改性成功，其亲水性提高显著．GeneO-COOH的主要失重表现为羧基官能团缩合以一个水分子的形态释放失去结构水［OH2］．复钙动力学曲线随着GeneO-COOH的浓度增加，曲线上升趋势由陡峭趋于平缓，当浓度为1.25μg/mL时复钙时间延长了11min，平台期OD值降低了8.14%；GeneO-COOH在0.5 100μg/mL浓度范围内溶血率均小于5%．GeneO-COOH比GeneO在同等低浓度下的抗凝血性能有一定程度的改善，主要是因为GeneO-COOH中—COO－带有负电，其与血浆蛋白的静电排斥和对凝血因子Ca2+的络合，使得GeneO-COOH的抗凝血性能有所提高．结果表明，羧基修饰氧化石墨烯是提高抗凝血性能的有效手段．关键词羧基；表面改性；氧化石墨烯；血液相容性中图分类号O613.71文献标识码A文章编号0251-0790（2010）12-2354-06二维炭材料自被发现以来引起了研究人员的广泛关注［1，2］，新型二维炭材料氧化石墨烯已成为研究热点．与昂贵的富勒烯和碳纳米管相比，氧化石墨烯价格低廉，原料易得，有望成为聚合物纳米复合材料的优质填料．近年来，Ruoff等［3］利用化学方法相继研制出石墨烯/聚合物导电纳米复合材料和无支撑的氧化石墨烯纸，使氧化石墨烯的应用研究成为热点［4，5］，而氧化石墨烯在生物材料领域的研究与应用却鲜见报道．2003年，我们课题组［6 10］开始研究氧化石墨以及聚合物/氧化石墨纳米复合材料在生物医药领域，特别是在抗凝血方面的应用．我们利用计算机模拟［11，12］研究，初步探讨了材料表面不同官能团与血液中蛋白片断相互作用的分子动力学原理，获知亲水性表面一般具有良好的生物相容性．极性基团（如—OH和—COOH）对水分子有较大的亲和能力．在水溶液中，—OH呈中性，—COOH可以部分电离而带有电荷．在亲水性表面，带电基团与表面带相反电荷的血浆、蛋白间的静电相互作用通常是血浆吸附到表面的驱动力，表面的吸附数量取决于它们之间的静电平衡［12，13］．正常人体血管壁内皮细胞的电位值为负值，血液中的红细胞、白细胞及血小板等均带负电荷，而—COO－也带有负电荷，不易发生粘附及其它相互作用．因此，羧基修饰的亲水表面有利于提高抗凝血性能．氧化石墨烯（Graphene oxide，GeneO）的结构与石墨烯大体相同，只是在六角环形片状体碳原子上连接有羰基、羟基、羧基和环氧基等官能团．表面化学组成对抗凝血性能有很大影响．为了发挥氧化石墨烯的优良性质，如提高它的溶解性及在基体中的分散性等，必须对其进行有效的功能化［14］．羧基改性的GeneO在功能化GeneO的制备中占有重要的地位．利用GeneO表面的活泼羧基，通过酰胺化或酯化反应，可使各种有机小分子、高分子、生物大分子以及含有活泼基团的功能材料被共价结合到GeneO上．本实验选用氯乙酸与氧化石墨烯在碱溶液中反应，以活化氧化石墨烯表面的环氧基与羟基，使其转变成为羧基，从而制得羧基改性的氧化石墨烯（GeneO-COOH）．通过红外光谱、热重分析和静态水收稿日期：2010-03-01．基金项目：国家自然科学基金（批准号：20874047）、江苏省自然科学基金（批准号：BK2009408）和“211工程”重点学科建设项目基金资助．联系人简介：周宁琳，女，博士，教授，主要从事生物功能材料的研究．E-mail：zhouninglin@njnu．edu．cn接触角实验对羧基的结构和含量进行了表征与测试．通过溶血实验和血浆复钙实验评价了改性前GeneO 和改性后GeneO-COOH 的血液相容性，证明羧基官能团修饰对氧化石墨烯抗凝血性能有较大影响．1实验部分1．1试剂与仪器石墨（粒度≤30μm ，国药集团化学试剂公司）；发烟硝酸（A．R．级，上海化学试剂有限公司）；氯酸钾（A．R．级，上海试四赫维化工有限公司）；一氯乙酸（A．R．级，上海金山化工厂）；氯化钙（A．R．级，天津市化学试剂六厂三分厂）；磷酸氢二钠（A．R．级，上海凌峰化学试剂有限公司）．成人全血及去血小板血浆由江苏省血液中心提供．KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）．FTIR Nexus 670型（Nicolet公司）红外光谱仪，实验条件为：分辨率4cm －1，扫描次数64次，扫描范围4000 400cm －1，KBr 压片；SL200B 型动态/静态接触角仪（美国科诺工业有限公司），测试条件：以水为接触角测试液，水体积3μL ；7系列热重分析仪（美国Perkin-Elmer 公司），测试条件：高纯氮气气氛，升温速率10ħ/min ，气流量50mL /min．1．2羧基化氧化石墨烯的制备称取1g 由改良的B 法［9，15］制得的氧化石墨（GO ），加入到一定浓度的碱液中超声分散2h ，得氧化石墨烯（GeneO ）胶体，再加入过量的氯乙酸［16］，继续超声2h ，将氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基．将溶液反复离心水洗至中性以除去杂质，得到均相的羧基化氧化石墨烯溶液，记作GeneO-COOH．1．3分析测试分别采用FTIR 光谱仪、动态/静态接触角仪和热重分析仪对所制备的羧基化氧化石墨烯进行表征和测试．1．4血液相容性测试1．4．1溶血实验取含抗凝剂的成人全血8mL ，加入含0.9%NaCl 的水溶液10mL 稀释，得稀释血液．用0.9%NaCl 配制不同浓度的GeneO 和GeneO-COOH 溶液，每管10mL ，于37ħ恒温30min 后加入稀释血液0.2mL ，轻轻摇匀，继续保温60min 后，以1000r /min 速率离心分离10min ，吸取上清液0.2mL 移入96孔板中，用BioTek synergy2酶标仪在545nm 处测定其吸光度值．用10mL 蒸馏水加0.2mL 稀释血液得阳性对照样品，用10mL 0.9%NaCl 水溶液加0.2mL 稀释血液得阴性对照样品．保温条件和测定方法与样品相同，实验组和对照组均取3管的平均值．溶血率按下式计算：溶血率（%）=D t －D ncD pc －D ncˑ100%式中，D t 为实验样品吸光度；D nc 为阴性对照吸光度；D pc 为阳性对照吸光度．若溶血率小于5%，则表明材料符合生物材料溶血实验要求；若溶血率大于5%，则表明材料有溶血作用［8］．1．4．2血浆复钙实验用0.9%NaCl 配制不同浓度的GeneO 和GeneO-COOH 溶液（0.5，1，1.25和2.5μg /mL ），于37ħ恒温30min．分别取0.025mol /L CaCl 2溶液、去血小板血浆（Poor platelet plas-ma ，PPP ）和待测溶液各0.1mL 加入到96孔板中，用BioTek synergy2酶标仪在405nm 波长处测定复钙时间动力学曲线．对照组采用0.1mL CaCl 2溶液加0.1mL PPP．每组实验重复3次取平均值［7］．2结果与讨论2．1FTIR 分析采用FTIR 光谱法分析了GeneO 的结构，由图1可见，其中含有羟基（3440cm －1）、羧基（1740，5532No．12徐东等：羧基化氧化石墨烯的血液相容性Fig．1FTIR spectra of GeneO （a ）andGeneO-COOH （b ）1630cm －1）和环氧基（1230，1060cm －1）．在强碱性条件下，用氯乙酸处理氧化石墨烯来活化环氧基和羟基，使部分的羟基转变为羧基，—OH 峰强减弱，—COOH 峰强增大，峰宽增加．2．2静态水接触角分析将一定浓度的GeneO 和GeneO-COOH 溶液均匀地倾倒在聚四氟乙烯盘中，放入80ħ鼓风干燥箱中加速水分的蒸发，GeneO 和GeneO-COOH 纳米片层自组装形成薄膜［5］，测试两者水接触角的大小．材料表面极性和非极性基团决定了材料的亲疏水性能［13］．图2呈现了分别在GeneO 和GeneO-COOH 表面的水滴形貌．实验测得GeneO 和GeneO-COOH 的水接触角分别为56.64ʎ和32.91ʎ，可见由于表面羧基的改性，GeneO-COOH 表面的亲水性能增强．亲水性表面与血液界面间的亲和性较大，使其界面自由能大大降低，减少了材料对血液中多种组分的吸附及其它相互作用，因而呈现出良好的抗凝血性能．Fig．2Images of water exposed to GeneO （A ）and GeneO-COOH （B ）2．3TG 分析对GeneO 和GeneO-COOH 薄膜在高纯氮气气氛下的热重性能进行了测定．由图3可见，GeneO （曲线a ）和GeneO-COOH （曲线b ）的表观水（n H 2O ）分别脱除3.4%和10.7%，初始分解温度分别为168.1和163.2ħ．羧基化过程使氧化石墨烯表观水含量增加．DTA 曲线上GeneO （图3曲线a '）和GeneO-COOH （图3曲线b '）的强放热峰温度分别为184.6和186.4ħ，两者在初始分解温度到200ħ之间的Fig．3TG and DTA curves of GeneO （a ，a'）and GeneO-COOH （b ，b'）失重均是内部吸附水（n H 2O ）造成的．TG 曲线的第三台阶表明GeneO （图3曲线a ）和GeneO-COOH （图3曲线b ）晶格被破坏，结晶结构内部两个—OH （曲线a ）或—COOH （曲线b ）以一个水分子的形态释放失去结构水［OH 2］的过程．该过程的最大失重峰所对应温度分别为297.7ħ（曲线a ）和304.4ħ（曲线b ）．该分解过程之后GeneO （曲线a ）和GeneO-COOH （曲线b ）的最大失重分别为25.4%和33.8%．在600ħ以上则为碳骨架的分解．2．4溶血实验分析溶血实验是通过测定红细胞溶解和血红蛋白游离的程度，对医用材料和制品的体外溶血性进行评价的体外实验．溶血实验在材料生物学评价中有特殊性，它不但能评价材料的血液相容性，而且对于残留小分子有毒物质有较高的敏感性，因而是一项特别有意义的筛选实验．此外，溶血性主要体现材料与血细胞相互作用的强弱，材料的溶血性高，表明对血细胞（主要是红细胞）的破坏程度大．红细胞的破裂也容易诱导血小板变形而引起凝血．表1列出了GeneO 和GeneO-COOH 的溶血实验结果，可见在0.5 50μg /mL 浓度范围内溶血率均＜5%，对红细胞的破坏程度很小，可进一步用于生物医用材料的制备中．而浓度在100μg /mL 时，GeneO-COOH 的溶血率仍低于5%，但GeneO 已超出材料允许6532高等学校化学学报Vol．31的正常溶血率范围．Table 1Results of hemolysis test of GeneO and GeneO-COOH2．5复钙实验分析血浆复钙实验是评价内源性凝血系统功能的一种方法．通过在去血小板血浆中加入Ca 2+，使可溶性的纤维蛋白原转化为可溶性纤维蛋白，进而使可溶性纤维蛋白交联成不溶物———血栓．血浆凝固时间越长，其血液相容性越好．待测溶液与加入Ca 2+的PPP 反应1h ，用酶标仪测出其复钙时间动力学曲线，当出现白色丝状物时曲线有明显的拐点，由此得出复钙时间．实验选取加入Ca 2+的PPP 作为对照组．经溶血率测试已初步筛选出符合材料使用要求的GeneO 浓度，为进一步研究样液的抗凝血性能，选取低浓度的对照组GeneO 样液进行实验．从图4可以看出，采用不同含量GeneO 从出现浑浊到产生大量白色丝状物的时间均比Ca 2++PPP 样液的时间延迟．Ca 2++PPP 样液复钙时间为18.0min ，OD 值为1.498．0.5，1，1.25和2.5μg /mL 的GeneO 样液的复钙时间分别为23.0，25.0，26.5和27.0min，平台期OD 值分别为1.371，1.314，1.402和1.297，复钙时间分别延迟了5.0，7.0，8.5和9.0min．OD 值分别减小了0.127，0.184，0.096和0.201．综合考虑复钙时间的延迟和产生白色丝状物量可知，2.5μg /mL GeneO 样液具有较好的抗凝血性能．Fig．4Kinetic profiles of recalcification time with different concentrations of GeneOa ．Without Ca 2+；b ．Ca 2++PPP ；c ．0.5μg /mL GeneO ；d ．1μg /mL GeneO ；e ．1.25μg /mL GeneO ；f ．2.5μg /mL GeneO．Fig．5Kinetic profiles of recalcification time with different concentrations of GeneO-COOHa ．Without Ca 2+；b ．Ca 2++PPP ；c ．0.5μg /mL GeneO-COOH ；d ．1μg /mL GeneO-COOH ；e ．1.25μg /mL GeneO-COOH ；f ．2.5μg /mL GeneO-COOH．从图5可以看出，不同含量GeneO-COOH 从出现浑浊到产生大量白色的丝状物的时间均比对照组的样液的时间有所延迟．对照组的样液复钙时间为18.0min ，平台期OD 值为1.498．而0.5，1，1.25和2.5μg /mL 的GeneO-COOH 样液的复钙时间分别为23，27，29和27min ，平台期的OD 值分别为1.347，1.369，1.376和1.285．复钙时间分别延迟了5，9，11和9min．OD 值分别减小了0.151，0.129，0.122和0.213．综合考虑，1.25μg /mL 的GeneO-COOH 样液具有较好的抗凝血性能．说明GeneO-COOH 样液在低浓度条件下已具备抗凝血性能，同时，并非浓度越高，其血液相容性越好．溶血率测试已经说明在一定浓度范围内，GeneO-COOH 样液的血液相容性较好．这可能是由于高浓度的7532No．12徐东等：羧基化氧化石墨烯的血液相容性GeneO-COOH 样液片层间氢键作用较强，多片层发生自组装，导致表面有效—COOH 官能团数量减少，抗凝血性能有所下降所致．从图6中可以看出，相同浓度的GeneO 和GeneO-COOH 样液从出现浑浊到产生大量白色的丝状物Fig．6Kinetic profiles of recalcification time with GeneO and GeneO-COOHa ．Without Ca 2+；b ．Ca 2++PPP ；c ．1.25μg /mL GeneO ；d ．1.25μg /mL GeneO-COOH．的时间均比Ca 2++PPP 样液的时间延迟．Ca 2++PPP 的样液复钙时间为18.0min ，OD 值为1.498.而1.25μg /mL 的GeneO 和GeneO-COOH 样液复钙时间分别为26.5和29min ，平台OD 值分别为1.402和1.376，复钙时间分别延迟了8.5和11min．OD 值分别减小了0.096（6.41%）和0.122（8.14%）．由于—COO －和血液中的血浆蛋白都具有负电性，两者产生静电排斥作用，阻止了血浆蛋白对其粘附作用，同时，—COO －可以直接干扰不溶性纤维蛋白网络的形成，从而使复钙的时间有显著的提高．因此，羧基修饰氧化石墨烯是提高抗凝血性能的有效手段．3结论（1）FTIR 和TG 分析表明，氧化石墨烯羧基化后，环氧基和羟基转变为羧基，官能团失重量增大，表现为两个—COOH －以一个水分子的形态释放而失去结构水［OH 2］；（2）体外溶血实验表明，在0.5 50μg /mL 浓度范围内，GeneO 和GeneO-COOH 的溶血率均小于5%，而100μg /mL 时GeneO-COOH 的溶血率仍低于5%，但GeneO 已超出材料允许的正常溶血率范围；（3）血浆复钙实验表明，各浓度GeneO 和GeneO-COOH 样液的复钙时间都比对照组延长，平台期OD 值降低．其中1.25μg /mL GeneO-COOH 样液的复钙时间比对照组延迟了11min ，平台期OD 值降低了8.14%．GeneO-COOH 比GeneO 在同等低浓度下的抗凝血性能有一定程度的改善；（4）静态水接触角测试结果表明，羧基化氧化石墨烯改性成功，其亲水性提高．由于—COO －的负电性，其与血浆蛋白的静电排斥和对凝血因子Ca 2+的络合，使得GeneO-COOH 的抗凝血性能提高．因而，表面官能团的羧基改性可以增强氧化石墨烯的血液相容性，可作为潜在的生物医用材料的填料．参考文献［1］Geim A．K．，Novoselov K．S．．Nat．Mater．［J ］，2007，6：183—191［2］Jang B．Z．，Zhamu A．．J．Mater．Sci．［J ］，2008，43：5092—5101［3］Dikin D．A．，Stankovich S．，Zimney E．J．，Piner R．D．，Dommett G．H．B．，Evmenenko G．，Nguyen S．T．，Ruoff R．S．．Nature［J ］，2007，448：457—460［4］ZHANG Tian-You （张天友），ZHANG Dong （张东）．J．Funct．Mater．（功能材料）［J ］，2009，40（10）：1695—1698［5］YANG Yong-Gang （杨永岗），CHEN Cheng-Meng （陈成猛），WEN Yue-Fang （温月芳），YANG Quan-Hong （杨全红），WANG Mao-Zhang （王茂章）．New Carbon Materials （新型炭材料）［J ］，2008，23（3）：193—200［6］ZHOU Ning-Lin 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in-tegrating into different environments such as biological fluids ，polymer matrices ，silicon surface and others．Graphene oxide was made through the ultrasonic separation of graphite oxide ，and then it was modified with functional group by chloroacetic acid ，and finally ，the graphene oxide modified with carboxyl groups was pre-pared．Compared with graphene oxide ，the FTIR spectrum of GeneO-COOH showed a weaker —OH peak ，a stronger —COOH peak ，and a bigger peak width．The results showed that partial epoxy and hydroxyl were ac-tivated into carboxyl．Static water contact angle showed that modification of GeneO with —COOH was success-ful ，and hydrophilicity of GeneO-COOH increased significantly．On TG curve ，the main mass loss of GeneO-COOH showed condensation of COOH groups in the form of a loss of structural water．The curve which reflec-ted the kinetic profiles of recalcification time was changed from steep to gentle along with the increases of the consistency of GeneO-COOH．The recalcification time of GeneO-COOH was prolonged by 11min at 1.25μg /mL ，and the value of OD reduced by 8.14%．The hematolysis ratio was less than 5%within a range of 0.5—50μg /mL．The anti-clotting property of GeneO-COOH was better than that of GeneO at the same low concen-tration．The improvement was mainly made by carboxyl group with a negative charge．Electrostatic repulsions between carboxyl groups and blood plasma proteins prevented the adhesion of plasma proteins on the surface of GeneO-COOH．Meanwhile ，direct complexation between carboxyl group and clotting factor could not be ignored．Then ，the recalcification time was significantly delayed．Therefore ，modification with carboxyl groups was a method to increase anti-coagulation effective of GeneO．KeywordsCarboxyl group ；Surface modification ；Graphene oxide ；Hemocompatibility（Ed．：H ，J ，K ）9532No．12徐东等：羧基化氧化石墨烯的血液相容性。