[17]　FDA news FDA add boxed waming for heart2related risk toantrdinbetes drug A vandial[E B/OL].2007211214.http//www.fdagov/bbs/topics/NEWS/2007/NEW0173him1. [18]　EMEA:Questions and answers on the benefits and riskof rosiglitazone[EB/OL].2007210218[2007212215].http//www.emeaeuropaeu/pdfs/human/press/pr/48446407en pdf.[19]　张杰.罗格列酮心血管安全性问题尚需监测与进一步评价[J].中国临床药理学杂志,2008,24(1):92294. [20]　Lars Slordal,Olav Spigset.Heart Failure Induced byNon2Cardiac Drugs[J].Drug Safety,2006,29(7):5672586.(收稿日期:2009202219)无血清培养基的研究进展梁　菁,李多伟(西北大学生命科学学院,陕西西安710069)摘要:目的　总结无血清培养基的组成、主要补充因子及作用、应用以及新近研究进展,为细胞培养等研究工作提供参考。

方法　查阅国内外文献资料进行整理和归纳。

结果　无血清培养基克服了完全培养基的种种弊端,且关于无血清培养基的研究取得了诸多进展。

结论　无血清培养基在生产实践中已得到广泛应用,进一步提高其通用性、降低成本、用于大规模生产的方法有待探索。

关键词:无血清培养基;补充因子;研究进展中图分类号:R97 文献标识码:A 文章编号:100422407(2009)0420325203 动物细胞培养技术近年来发展迅速。

传统的含血清培养基中的血清给生产与科研带来多种不利因素。

血清的主要作用在于给细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质,但其存在多种缺点:具有批间差异、需要大量验证工作、使用不方便、成分不明确、有抑制生长的成分、不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化、容易被病毒和支原体感染;血清昂贵,可能发生供应紧张,血清的来源不稳定等问题。

无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分,既能满足细胞的培养要求,又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。

因而无血清培养基得到了越来越普遍的应用,而且无血清培养基技术也迅速发展并取得了许多进展。

1　无血清培养基的发展过程无血清培养基的发展大致经过了三代,第四代培养基的研制开发并投入市场将成为发展趋势[1](见表1)。

表1　无血清培养基的发展过程成分优缺点第1代不含血清,但含有大量的动物或植物蛋白如BSA和动物激素等。

蛋白含量高(低于有血清培养基),不利于目标蛋白的分离纯化,降低回升率,增加成本。

第2代完全不用动物来源蛋白(无动物衍生蛋白)。

降低生产成本,加快报批的速度(目前市面上销售的主要产品)。

第3代完全没有蛋白或含量极低。

化学成分确知,细胞培养与生产容易做到恒定,分离纯化容易,成本低,管理容易。

仅限于应用几株细胞系。

第4代无血清,无蛋白。

适合多种不同细胞生长并可高温消毒。

2　无血清培养基的组成及其主要补充因子无血清培养基一般认为是由两部分组成,即基础培养基和替代血清的补充因子。

2.1　基础培养基　无血清培养基的基础培养基一般为与所需培养细胞相应的合成培养基,是按细胞生长需要由一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等组成的。

在对不同的细胞进行培养时可根据需要对基础培养基和某些组分进行相应的调整。

2.2　补充因子　补充因子是无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称。

这些补充因子可使培养基既能满足动物细胞培养的要求,又能有效避免血清培养基成分不明确、有批间差异、常被病毒和支原体污染、血清来源不稳定、细胞产品不易纯化等问题。

补充因子可分为如下几类[2]。

2.2.1　激素和生长因子　激素可分为多肽类激素和甾体类激素。

多肽类激素有胰岛素、生长因子、胰高血糖素等;甾体类激素有孕酮、氢化可的松、雌二醇等。

多肽类生长因子有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等[3]。

在细胞无血清培养中,胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成,抑制细胞凋亡,是重要的细胞存活因子[3]。

Jan等[4]认为在批式培养中胰岛素迅速耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。

生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。

氢化可的松能促进细胞贴壁和细胞分离,在某些情况下会诱导细胞生长和诱导细胞分化[3]。

2.2.2　结合蛋白　无血清培养基中的结合蛋白主要是白蛋白和转铁蛋白。

白蛋白可通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定并调节上述物质在无血清培养基中的活性,此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用[1,5]。

大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体,受体与转铁蛋白/Fe3+复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源,此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其它微量元素如钒等结合[6]。

2.2.3　贴壁和铺展因子　绝大多数的动物细胞在体外生长时需要固着于适宜生长的基质上,并铺展成一单层,才能开始增殖。

目前在无血清培养中常用的贴壁和铺展因子有纤黏蛋白、胶原、聚赖氨酸、昆布氨酸、血清铺展因子等[1,2]。

2.2.4　微量元素和低相对分子质量营养元素　一些细胞系的无血清培养还需要补充某些低相对分子质量的化学物质,如微量元素、维生素、脂类等。

微量元素能消除过氧化物酶和氧自由基对细胞的损害,维生素参与代谢、抗氧化等[3],维生素B主要以辅酶的形式参与细胞代谢,维生素C和维生素E 具有抗氧化作用。

丁二胺和亚油酸等提供细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质[1]。

2.2.5　酶抑制剂　有时将细胞用酶处理后会有一些酶残留,此时若不对残余的酶加以处理可能会对细胞不利,应加入相应的酶抑制剂终止残余酶的作用以达到保护细胞的作用。

3　无血清培养基的研究进展由于近年来动物细胞体外培养技术的迅速发展以及无血清培养基在动物细胞培养中的广泛应用,与无血清培养基相关的研究在近几年来也取得了很大的进展,主要表现在以下方面。

3.1　有关无血清培养基的新方法　在人牙龈上皮细胞培养中,血清成分能使培养的组织块更好的贴壁,因而传统的组织块培养法在培养过程中始终应用有血清的培养基,但血清中高浓度的钙离子会诱导上皮细胞分化,加速角化物的形成,从而降低上皮细胞分裂、增殖和游走的能力[7]。

赵宝红[7]等在培养到一定阶段后,应用无血清的EpiLife角化上皮细胞专用培养基,通过降低培养基中钙离子的浓度,增加表皮生长因子等成分,延缓上皮细胞的分化,抑制成纤维细胞的生长,试图加速上皮细胞的分裂、增殖,提高原代人牙龈上皮细胞培养。

该法培养的成功率高,达到90.6%,前3代细胞具有和原代细胞相似的形态,高效率地为实验研究提供了与原代生物学性状相似的人牙龈上皮细胞。

还有报道用基因工程手段提高哺乳动物对无血清培养基适应性的研究。

无血清培养基所必需的胰岛素和转铁蛋白以动物为来源,并没有消除血清带来的安全隐患,能否利用细胞自身分泌表达以上2种成分并促进自身生长将有效解决上述难题。

利用基因工程表达部分改善其生长的外源因子将有助于哺乳动物细胞适应大规模无血清培养[8]。

3.2　在具体细胞系或细胞株培养方面的新应用　无血清培养基通用性不高,不同类型的细胞株或细胞系都可能需要一些各自特定的无血清培养基添加成分。

因此很多研究都是关于怎样改进无血清培养基的配方或与一些方法相结合以期更好地促进细胞生长增殖或提高目的产物表达的。

黄慧[9]等采用Dispase酶和胰酶联合消化的无血清、无滋养层培养法,在体外成功地对大鼠口腔黏膜角质形成细胞进行了连续培养,证实这种方法比传统角质形成细胞培养法能提高细胞存活率和避免成纤维细胞污染。

刘昕[10]等发现角质形成细胞无血清培养基有助于人外根鞘细胞的生长和传代,是较合适的培养基并且向其中添加0.01～0.05mmol・L-1米诺地尔能够促进外根鞘细胞的增殖,而0.1mmol・L-1以上浓度反而抑制其生长,从而将人外根鞘细胞的无血清培养基加以优化。

田志红[11]等采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的无血清培养基对大鼠胚胎大脑组织细胞悬液进行培养,结果显示细胞接种密度以2×(104～105)mL-1生长良好(r=0.95,P<0.05),说明无血清培养基分离培养的胎鼠脑组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力,建立了胎鼠神经干细胞体外培养方法。

3.3　无血清培养基中各种补充因子的性质和作用　文献[12]报道,在培养基中添加胰岛素、氢化可的松、亚硒酸钠和转铁蛋白有助于内蒙古白绒山羊初级毛囊的生长和形态的维持。

罗海龙[13]等采用无血清培养基培养新生大鼠海马来源的神经干细胞研究胰岛素样生长因子2Ⅰ与不同浓度的促红细胞生成素对新生大鼠海马来源的神经干细胞向神经元方向分化的影响,发现胰岛素样生长因子2Ⅰ和不同浓度的促红细胞生成素都促进神经干细胞向神经元分化,且在一定浓度范围内胰岛素样生长因子2Ⅰ和促红细胞生成素具有协同效应。

文献[14]报道,分别加入基因重组人苗勒氏管抑制因子及人胰岛素样生长因子2Ⅱ作用于颗粒细胞,发现人苗勒氏管抑制因子和人胰岛素样生长因子2Ⅱ可单独或协同卵泡刺激激素刺激颗粒细胞甾体激素的分泌,对卵泡的生长发育及卵母细胞的分化成熟起着微观调控作用。

3.4　细胞的生长分化条件研究　无血清培养基成分是已知的,可以研究其加入某些成分对细胞生长分化的影响。

有文献[15]报道,向无血清培养基中加入不同浓度的氨使细胞内氨基己糖增加,影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。

氨抑制谷氨酸胺代谢途径,使天冬氨酸和谷氨酸的消耗增加,影响细胞的氨基酸代谢。

同时,氨浓度的提高改变了细胞内局部微环境,影响细胞的正常生理功能。

乳酸对杂交瘤细胞生长代谢的影响表明,当乳酸浓度低于5.3mmol・L-1时,乳酸对细胞生长和代谢无明显影响;在10～25mmol・L-1时,对杂交瘤细胞的生长代谢有弱抑制;高于34mmol・L-1时,对细胞生长代谢有较明显的抑制[16]。

无血清培养中的代谢副产物丙氨酸对杂交瘤细胞生长代谢也有影响,在0～8.9mmol・L-1范围时,丙氨酸对细胞生长影响不大,对单抗的生成没有直接影响,但对细胞代谢有较大的影响。

随着丙氨酸浓度的提高,葡萄糖的消耗和乳酸的生成增加,而丙氨酸和氨的生成减少[17]。

3.5　肿瘤细胞和肿瘤发生机制　周清[18]等探讨采用无血清专用培养基从肺癌患者外周血单核细胞快速培养树突状细胞的方法发现,树突状细胞培养基培养的树突状细胞得率和纯度、共刺激分子表达水平、刺激胸腺依赖淋巴细胞增殖能力均优于含血清培养基,证明无血清树突状细胞专用培养基可以在体外快速培养临床级树突状细胞,为肿瘤免疫治疗奠定基础。