活泼酯基易和蛋白质的游离氨基反应 。
2、标记方法 标记Ag或Ab
方法：电泳 层析 超速离心
液相用液体闪烁 仪计数，固相用 X射线胶片显影
标记物纯化
抗原抗体反应 聚乙二
醇沉淀 分离
测定其放射活性
抗原抗体复合物沉淀
3、检测方法：直接法和竞争法 1）直接法：放射活性与抗体浓度呈正比 Ag＊-Ab 沉淀分离 放射活性测定 Ag＊＋Ab （定量） 2）竞争法：放射活性与待测抗原（未标记）浓度呈反比 体外条件下，由非标记抗原（抗体）与定量的标记抗原 （抗原）对限量的特异性抗体（抗原）的竞争性抑制的反应。
抗原电泳
抗体扩散
形成沉淀线
B、操作步骤： 先将抗原进行电泳，分离成不同的区点（带）； 在琼胶中沿电泳方向挖一平行小槽，加入抗血清，让抗原 和抗体进行自由扩散，两者在合适的比例下形成沉淀弧。
根据各蛋白所处的电泳位臵，可分为： 白蛋白区、球蛋白α1区、球蛋白α2区、球蛋白β区、 球蛋白γ区
正常血清
待测抗原
表中＋～＋＋＋代表出现沉淀线的强度， 如： 1:8 、1:16抗体出现中等浓度沉淀线， 1:32出现较弱的沉淀线。 抗血清的效价为 1:16 最佳抗原浓度为： 1:16
3、免疫电泳： 利用蛋白质在凝胶中电泳移动速率不同而被分离的特性 与免疫琼脂扩散结合起来的分析方法。 1）原理： PH8.6时，混合蛋白抗原多数带负电，向正极移动（少数 带正电的则向负极移动），不同抗原分子因大小及所带 电荷不同，其电泳速度不一样而被分离。 2）特点： 加快反应速度；提高免疫沉淀的灵敏度。 3）免疫电泳的方法 ① 血清免疫电泳 A、方法：
应用： 定性与定量分析，常用于测定血清中IgG、IgM、 IgA及补体的含量。
2）双向扩散法（Ouchterlony法）：
在琼脂糖凝胶平板内打两排孔，孔中分别加入抗原、抗 体，抗原、抗体分别呈辐射状向含胶内扩散，当抗原与
抗体在胶内相遇，且二者的量达一定比例时则形成可见
的沉淀线。 应用： ① 定性分析：
2）溶血反应： 红细胞与相应抗体特异性结合后，在有足量补体存在条件 下，出现红细胞溶解的现象。
3）补体结合反应 ： 在补体参与下，并以绵羊红细胞和溶血素（抗绵羊红细胞 的抗体）为指示系统的抗原抗体反应。 3、补体结合反应系统： ① 检（待）测系统： 待测的抗原+ 抗血清（抗体、补体） ② 指示系统： 绵羊红细胞（抗原）+ 溶血素（抗体） ③ 补体系统 豚鼠的新鲜血清
沉淀弧可显示样品与对照血清蛋白组分的增加或减少情况
② 对流免疫电泳（电渗析）： 在电场的作用下，抗原、抗体进行相对运动，具有定向加 速度的免疫双扩散技术 。 方法及原理： 琼脂板上打两排孔，负极孔加待测抗原，正极孔内加相应 抗体，通电后，带负电荷的抗原泳向正极抗体侧，而抗体 （PH8.6时带负电）藉电渗作用流向负极抗原侧，在两者间形 成沉淀线。（电渗：电场中液体对于固体支持物的相对移动）
② 间接凝集反应（检测可溶性抗原或抗体）： 将可溶性抗原吸附于与免疫无关的小颗粒（载体）表面 后，与相应的抗体在电解质存在的下而发生的凝集反应。
常用载体颗粒： 红细胞 [人（ O 型）和动物（绵羊、兔鸡等）]、胶体颗粒、 聚苯乙烯乳酸、活性碳等 间接血细胞凝集试验：以红细胞作为载体的凝集反应。
③ 凝集抑制实验 将可溶性抗原与相应抗体预先作用，然后再加入致敏颗粒 （吸附相同可溶性抗原的乳胶颗粒）, 由于抗体已被可溶性 抗原结合, 因而致敏颗粒不发生凝集现象。如免疫妊娠实验 测验尿中HCG（乳胶凝集抑制试验，无凝集者为阳性）。
4、反应过程
抗原 + 抗血清 + 豚鼠新鲜血清 检（待）测系统
溶血
红细胞+溶血素
指示系统 补体结合阴性反应 （－），无待测物
补体系统
不溶血
补体结合阳性反应 （＋），含待测物
二、 常见免疫分析方法 1、免疫分析的定义： 利用抗原抗体的特异性反应的特性对抗原或抗体进行量和 质的测定分析。 2、特点： • 特异性强 • 灵敏度高 • 反应速度快
氯胺T法标记原理：
氯胺T 是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的
氯离子将碘离子( I- )氧化为单质碘( I2 )，单质碘与抗原 或抗体分子上的苯丙氨酸及酪氨酸残基的苯环或组氨酸 的咪唑基共价相连，使之发生碘化反应。
125I，131I的标记
— 氯胺T法：
2）3H的标记 —（N - 琥珀酰亚胺[2，3-3H]丙酸酯 ）
鉴别抗原与抗体反应间的特异性如何：根据相邻孔中 不同抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化 判断抗原间是否存在共同的AD。
② 定量分析：
测定抗血清效价及抗原的最佳浓度。
两孔抗原
完全融合
互不干扰 的交叉线
向共同Ag 方向突出 同一血清与不同抗原反应
定性分析
双向免疫扩散定量分析：测定抗血清效价及抗原的最佳浓度
一）免疫沉淀 1、环状沉淀反应
应用：抗原抗体的定性及定量分析。 方法：试管法，玻片法
常用已知抗体来 检测未知抗原。 定量实验时，由 于抗原分子小， 反应面积大，且 为保证Ag与Ab 的适宜比例，有 足够的抗体参与 反应，操作上通 常是稀释抗原 （上层），而不 稀释抗体（下层） 与图示相反
2、凝胶扩散沉淀 1）单向扩散法（Mancini法）： 将抗血清均匀地混合于琼脂糖凝胶（浓度为：0.8~1% ） 内，倒平板，平板打孔，孔中加入待测的抗原样品，抗 原呈辐射状向含抗体的胶内扩散，至抗原与抗体的量达 一定比例时形成可见的沉淀环。 一定条件下沉淀环的直径或面积与相应的抗原含量成正比。
② 絮状沉淀反应： 将已知抗原与抗体在试管内混匀后，出现肉眼可见的絮 状沉淀的现象。 ③ 凝胶扩散试验： 利用可溶性抗原、抗体在半固体琼脂内扩散，在其扩散 的某一部分出现白色沉淀线的现象。 凝胶扩散实验分为： 单向琼脂扩散（定性、定量分析） 双向琼脂扩散（定性分析） 三）中和反应： 抗体使相应抗原（毒素或病毒）的毒性或传染性丧失的反应 。 抗毒素：使相应毒素失去毒性的抗体。
显色反应
加入酶作用底物
2、 用于标记的酶： 碱性磷酸酶（AP）、辣根过氧化物酶（HRP）、脲酶、 β- 半乳糖苷酶等。
Ag-Ab酶 或 Ab-Ag酶
• 不同的酶催化的底物不同，显色产物吸收的波长不同。 • 有显色反应为正反应；无显色反应为负反应。 • 被检测的抗原或抗体的量与显色产物的量呈正比。
3、方法 （1）直接法（可检测抗原或抗体）：
不含待测抗原，产生凝集，但为阴性反应
+
含有待测抗原，不凝集，阳性反应

+
+

Patient’s sample
二）沉淀反应： 1、定义： 可溶性抗原与相应抗体在一定条件下，出现细微沉淀物的 现象。
2、参与因素： ① 沉淀原：参与沉淀反应的抗原。 包括：蛋白质、多糖和类脂溶液、血清、细菌抽提液、 组织浸出液等。 ② 沉淀素：参与沉淀反应的抗体。 3、类型： ① 环状沉淀反应： 将已知抗原（抗体）注入特制小试管中，再沿管壁徐徐加入 适量抗体（抗原），在两液界面出现白色的沉淀圆环的现象。
反应特点： 灵敏，精确 不稳定 安全性差
放射性同位素标记分析法示意图
（二）酶联免疫吸附试验（ELISA）
将待测抗原或抗体吸附于固相表面（聚苯乙烯微量反应 板） ，与酶标记的抗体或抗原反应后，加入底物反应（显 色或发光）的分析方法。 1、原理 酶标板吸附 抗原或抗体 洗涤 加入酶标抗体或抗原
抗原 稀释度 不稀释 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 抗血清稀释度 不稀释 ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ 1/2 ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋ 1/4 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ 1/8 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ 1/16 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － 1/32 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － 1/64 1/128 － － － － － － － － － － － － － －
③ 流程
固相固定Ag
酶标板吸附抗体 底物Ag来自Ab - Ag洗涤
Ab酶
Ab - Ag - Ab酶
显色反应
② 间接夹心法
酶标板吸附抗体 洗涤
2Ab酶
Ag
Ab － Ag
1Ab
Ab － Ag－ 1Ab
Ab －Ag－1Ab－ 2Ab酶
底物
显色反应
酶联免疫吸附实验——夹心法
（三）荧光与发光免疫分析 用荧光素（异硫氰酸荧光素、藻红蛋白）或发光化合物标记 抗体/抗原，再与吸附于固相表面的抗原/抗体反应，激发抗 原抗体复合物发（荧）光，借此对抗原/抗体进行定性或定位。
第五节 常见免疫分析方法
一、抗原抗体反应类型 凝集反应、沉淀反应 、中和反应、补体参与的反应等。
一）凝集反应 ： 1、定义： 颗粒性抗原与相应抗体相遇后，在电解质参与下出现肉眼 可见凝集物的现象。 2、参与要素： ① 凝聚原：参与凝聚反应的抗原，如：血细胞、菌体等。 ② 凝聚素：参与凝聚反应的抗体。 3、类型 ①直接凝集反应（定性实验，检测抗原或抗体）： 颗粒性抗原与相应抗体在有电解质时，直接结合所出现 的凝集现象。 常用方法： A、玻片法：细菌及ABO血型鉴定（标准血清检测抗原） B、试管法：肥达氏反应（伤寒或副伤寒杆菌标准液检测血清 ）
中和抗体：使相应病毒丧失传染性的抗体。 中和反应应用： 毒素或病毒种型的鉴定与抗原性分析； 抗毒素或中和抗体的效价测定。 四）补体参与的反应
1、反应特点： 抗原抗体复合物激活补体，被活化的补体成分可与抗原 抗体复合物结合；补体被复合物结合后即被消耗。 2、反应类型 1）溶菌反应： 某些革兰氏阳性菌，与相应抗体结合后，形成抗原抗体 复合物，在加入补体，则出现的细菌溶解现象。
琼脂中含SO42-，带负电，其静 电感应使附近水带正电，而向 负极移动。电泳时有电泳力和 电渗力两种力。若物质原来带 正电，向负极移动，则因电渗 作用向负极移动得更快。若物 质向正极移动，所带电荷少， 电泳力小于电渗力，也向负极 移动，如：血清中的γ球蛋白