及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求，因此要测定DNA的浓度和纯度。
• 组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250～270nm之间，腺嘌呤
的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶： 259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是 260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线 下，10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡聚核 苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。 分光光度法不但能够确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值 （A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说 明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收 表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要 结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度 法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
• Tips：当A260/ A280比值<1.9时，该样品可适当稀释，用饱和的酚、
氯仿、异戊醇抽一次，再用无水乙醇沉淀、抽干。
• 当A260/ A280比值大于2时，则RNA浓度过高，要去RNA
谢谢聆听
Thanks
• c为100ml溶液中所含物质的重量（按干燥品或无水物计算），g； • l（L）为液层厚度，cm。 • 上述公式中吸收系数也可以摩尔吸收系数ε来表示，其物理意义为溶液浓度c为1mol/L和液层厚度
为1cm时的吸光度数值。在最大吸收波长处摩尔吸收系数表示为εmax。
• 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。在一定条件下，物质的
分光光度计使用方法
Use method of spectrophotometer
分光光度计使用方法
①选取合适的按键
• • • •
待测定样品为dsDNA（如PCR产物），按下键“7/dsDNA”
待测定样品为ssDNA（如反转录合成的第一链cDNA产物），按下键“8/ssDNA”
待测定样品为RNA，按下键“9/RNA” 待测定样品为Oligo（如PCR引物），按下键“6/Oligo”。
紫外验原理
• 紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于
鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光 的吸收程度随光的波长不同而变化。因此，通过测定物质在不同波长处的 吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。从吸 收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。物质的吸收 光谱具有与其结构相关的特征性。因此，可以通过特定波长范围内样品的 光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过 测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。用于定量时，在最大吸收波 长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度 进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
仪器分类
• 依据光谱区，分光光度计可分为：紫外分光
光度计，可见分光光度计（或比色计）、红 外分光光度计。如果吸光质点是原子，其仪 器称为原子吸收分光光度计。
• 仪器组成 • 各种分光光度计的基本组成是：光源系统、
分光系统、吸收系统和检测系统。
• 仪器精度 • 为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应
吸收系数是恒定的，且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。当已知某纯物质在一定条 件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试 品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在 一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称之为比色分析。
操作步骤
• 吸取5µ L DNA样品或4µ L RNA样品，加水至1ml混匀后，转入分光光度计的石英比
色杯中。如果样品很少，可以用0.5ml的比色杯，上述核酸样品与水的用量缩小一 半。 先用1ml水对分光光度计校正为零点。 在260nm和280nm分别读出光密度，DNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 50/1000；RNA样品的浓度OD260 × 核酸稀释倍数 × 40/1000；浓度单位为μg/µ L。 按步骤1的稀释方式，DNA或RNA的浓度（μg/µ L）均为OD260的10倍；如OD260 为0.1，则样品的浓度就为1μg/µL DNA或RNA。这样稀释倍数非常便于计算。 若为DNA样品，OD260/OD280比值大于1.8，说明仍存在RNA，可以考虑用RNA酶 处理样品；小于1.6，说明样品中存在蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，用乙醚抽 提后，以乙醇沉淀纯化DNA。RNA样品OD260/OD280比值小于2，也应该考虑再 用酚/氯仿抽提。
按照国家计量检定规程，定期进行校正检定。
分光光度法测定DNA的浓度和纯 度
Determination of DNA concentration and purity by spectrophotometry
分光光度法测定DNA的浓度和纯度
• 在实验过程中，很多时候提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连接
②将空白对照置入样品孔。
• 注意：空白对照是空白液，并非所有情况都是水。例如，用Tris溶液溶解DNA样
品，则要用Tris液做空白对照。
分光光度计使用方法
• ③按下 “Blank”键。仪器记录空白对照，设置为0.000A。 • ④将样品置入样品孔，按下“Sample”键，仪器显示样品的吸光度
和浓度值，以及其他相关参考比值。
• 单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层
的厚度（光路长度）成正比，其关系可以用朗伯-比尔定律表述如下：
• • • •
A=lg 1/T=Ecl
A为吸光度； T为透光率； E为吸收系数，常用的表示方法 ，其物理意义为当溶液浓度为1%（g/ml）,液层厚度为1cm时的吸 光度数值；