“创新性实验计划”项目研究中期报告
鸟类分子遗传关系研究
---基于Sox基因DNA 片段方法
摘要
根据多种动物Sox基因的HMG-box序列设计 一对特殊的简并引物，PCR扩增了鹌鹑、鹧鸪和 鸽子三种鸟类的Sox基因DNA片段,得到了大小和 数目不同的DNA片段，结果在鹌鹑个体发现了两 个约为200bp和1100bp的DNA片段，在鹧鸪个体 发现了三个约为200bp、1000bp和1200 bp的 DNA片段,在鸽子个体发现了五个约为200bp、 300bp、400bp、500bp和600bp的DNA片段。此 外，通过对其中200bp的DNA片段进行测序，通 过序列比较，分析了三种鸟类间的分子遗传关系。 本实验在建立鸟类的分子遗传特征标记和分析不 同鸟类之间的分子遗传关系方面具有重要的意义。
1.4克隆 对于需要进一步做序列分析的样品的 DNA片段用上海Sangon公司胶回收试剂盒 纯化，纯化方法参照产品手册进行。将回 收的DNA片段克隆于载体pMD18-T （TakaRa公司），然后进行连接反应及细 菌转化.
1.5测序和序列分析 选取阳性克隆菌落，提取重组质粒pMD18T，经过菌落PCR和酶切鉴定后，由上海 Sangon公司对阳性克隆进行测序，采用相 关软件进行核苷酸和氨基酸序列同源性比 较，根据其与查询序列的最高相似性而命 名所得克隆。
分子遗传标记方法主要有以下五种：1）线粒体DNA （mtDNA）分子标记；2）基于Southern杂交的分子标记， 如限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)，荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridiztion, FISH）和单链构象多态性 (SingleStrand Conformation Polymorphism，SSCP)；3）基于 PCR的分子标记技术，如随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA, RAPD），扩增片段长 度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP）和单链构象多态-DNA聚合酶链式反应(SingleStrand Conformation Polymorphism-Polymerase Chain Reaction, SSCP-PCR)；4基于重复序列的分子标记，如 微卫星DNA和小卫星DNA；5）基于mRNA的分子标记， 如逆转录PCR (Polymerase Chain Reaction) 和差异显示 逆转录PCR[2]。
鹌鹑（Coturnix coturnix）和鹧鸪（Francolinus pintadeanus）均属鸡形目雉科，鸽子（columba） 属于鸽形目鸠鸽科，三种鸟类在自然界分布广泛。 我们以三种不同的鸟类为材料,提取基因组DNA, 利用大量不同物种中Sox基因HMG-box保守区序 列设计特殊的简并引物,应用PCR、分子克隆和测 序等方法在不同动物样品的基因组DNA中得到大 小，数目和序列有差异的Sox基因的DNA片段， 通过对不同样品的Sox基因DNA片段的比较分析 来研究不同鸟类等动物之间的遗传特性和遗传关 系。本实验的结果可作为一种分子遗传标记，既 适用于简单快速的区分不同鸟类及其他亲源关系 相近的动物，也可广泛应用到对动物的遗传变异 分析、遗传育种以及珍稀动物保护等方面。
上述几种分子标记方法都存在各自的局限性，要 么操作复杂,要么稳定性和重复性较差,有的还需 要使用同位素等，而全基因组测序的方法又存在 成本高、费时长等不足。在本研究中，我们设计 了Sox基因HMG-box中的保守区的特殊简并引物， 在47个不同动物样品中进行Sox基因的扩增，在 不同样品中得到了大小和数目不同的Sox基因的 DNA片段，对于获得相似DNA片段的不同样品， 我们再结合测序方法进行分析，由此得到一个不 同动物种类的分子遗传标记。本研究方法结合了 上述两类方法的特点，具有既快捷、方便，又准 确有效的优点，是一种新型的鉴别和分析不同动 物的分子遗传特征和分子遗传关系的方法。
2结果
图1 1.鹌鹑；2. 鹧鸪；3.鸽子；4.红鲫；5.100bp mark

我们将选择部分样品的Sox基因DNA 片段进行了测序和命名,并且将序列提交到 gengbank数据库。特别是对于获得的Sox 基因DNA片段的数目相同且大小相似的不 同样品，我们进一步采取测序方法进行序 列的比较分析。
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1、材料和方法
1.1实验材料
鹌鹑、鹧鸪和鸽子分别购自长沙下河街水产市场， 均为性成熟个体，从静脉取血，加入ACD抗凝剂， 充分混匀，－80℃保存。基因组DNA按照上海 Sangon的UnlQ-10柱式DNA抽提试剂盒方法分别 提取，将每个动物样品的不同个体提取出的DNA 混合在一起作为实验模板，以避免个体差异。提 取的DNA用紫外分光光度计检测纯度，—20℃保 存。
1.2设计引物 参照Sox基因保守区序列，由Sangon公司 合成。上游引 物 :5′TGAAGCGACCCATGAAC/TG 3′、下 游引物: 5′AGGTCG（A/G）TACTT（A/G） TA（A/G）TT 3
1.3 PCR扩增DNA 反应程序∶预变性：94℃ 3分钟；5个循环： 94℃变性40秒、45℃退火40秒、72℃延伸 1分钟；30个循环：94℃变性40秒、52.3℃ 退火10秒、72℃延伸1分钟；终延伸：72℃ 7分钟 然后将PCR的产物进行琼脂糖电泳，在CIS 凝胶系统中检查.

目前,已在进化位置明显不同的各类物种如哺 乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类以及昆虫中 克隆出了40多个Sox基因,而性别专一的Sox基因 仍只见于哺乳动物雄性中.因此,现在一般认为SRY 基因是逐渐积累的,含有性别决定基因的染色体经 倒位,重排,避免交换,从而导致性染色体的分化.在 对Sox基因序列和功能进行了研究后今发现的所 有Sox基因,按其HMG-box盒的同源性程度,可划分 为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个不同 的亚族,分别参与诸如性别决定、骨组织的发育、 血细胞生成过程、神经系统的发育以及晶状体的 发育等多种早期胚胎发育过程。如C组的Sox4基 因参与心脏管腔发育，E组的Sox9基因参与睾丸 的发育，F组中的Sox11基因参与中枢神经系统的 发育。
前言
人的睾丸决定基因(SRY)的分离 是性别决定及分化机制研究领域的一 个重大突破, 它的发现诱发了Sox基因 家族的研究热潮.Sox基因家族是在动 物中发现的一类新的编码转录因子的 基因家族,其产物具有一个HMG基序保 守区其编码的蛋白质可以和DNA序列 特异性结合,是一类重要的转录调控因 子,其发现及其在进化中的保守性为性 别决定机制及其在个体发育过程中的 作用提出了新的研究课题。