• A.tumefaciens carrying the disarmed Ti plasmid
3. Binary vector
• T-DNA does not need to be physically attached to the rest of the Ti plasmid
• Use separate plasmids to supply the disarmed T-DNA and the virulence functions
植物Ti质粒载体
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions） T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒 上导入植物细胞的一段DNA。
➢T-DNA两端各有一段25bp的重复序列(LB, RB)。 T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基 因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态， 形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。 ➢Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留 T-DNA两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直 接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细 胞不具有成瘤能力。
Pnos Kan
Tnos
PcaMV GUS Tnos
pBI12（1 13kb）
Kanr
pAL4404 170kb
Vir
▪ The small plasmid can be used to inserted foreign gene ▪ When the two plasmids present together in the same
1） Disarmed Ti vectors
• 去除T-DNA中 的肿瘤基因
• 在T-DNA中插 入用于转化植 株筛选的遗传 标记基因
pBR322
AmpR 25 bp 重复区
Opine 合成
25 bp 重复区
pGV3850
Vir
Intermediate vectors
• A small portion of T-DNA was subcloned in a conventional E.coli plasmid vector (i.e. pBR322) for easy manipulation, producing intermediate vectors
第三节 其他载体
2012.09
其他载体
• 一、人工染色体 • 二、植物基因工程载体 • 三、动物基因工程载体
一、人工染色体
人基因组十分庞大，约（ yeast artificial chromosome,YAC）载体 应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（ telesome）、着丝点(centromere)及复 制起点等功能序列，可插入长度达200500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以 随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成 为人基因组研究计划的重要
➢在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，合 成互补链形成双链形式的T-DNA分子。 在一 系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合 是一种非正常重组。
2、Ti质粒载体
• Disarmed Ti vectors（非致瘤载体） • Cointegrate vectors（共整合载体） • Binary vectors（双元载体）
Ri质粒
T区与Ti质粒的T-DNA十分相似： ✓①T区的左右边界序列。左右边界上含有 25bp的重复序列。 ✓②TL-DNA区。该区中含有与毛状根形成有
关的rolA、B、C、D基因群。
✓③TR-DNA区。该区中含有与农杆碱合成有 关的基因（ags）和生长素合成有关的基因
（tms1、 tms2）。ags基因在转化的初期起
YAC载体
正常酵母人工染色体含有： * 四膜虫端粒（tel) * 酵母自主复制序列（ ARS) * 酵母着丝点 (CEN) * 酵母的选择标记 (TRP1、 URA1)
The functional elements of a yeast chromosome
the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping
Triparental mating
• An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in trans
• The E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vector
（3）Con区(regions encoding conjugations)
该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），
调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。
（4）Ori区(origin of replication)
该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始 区。
T-DNA转移的机制
➢Ti质粒分子受到信号分子的激活作用之后， virD基因编码的一种核酸内切酶，先在TDNA的RB序列中的第3和第4碱基之间切开一 个单链缺口，随后在T-DNA同一条链的LB序 列中切出第二个单链缺口。 ➢T-DNA便以单链形式释放出来，并在RB序 列的引导下定向地转移到寄主植物细胞。
• Intermediate vectors are incapable of replication in A.tumefaciens and also lack conjugation functions.
• Transfer of them was achieved using a triparental mating.
1、酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC)
酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）
◆酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。 具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌 和酵母菌中选择的标记基因。
◆ YAC可以接受100-1000 kb的外源DNA片段， 这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位 克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人 类人工染色体(human artificial chromosome， HAC)的研究。
着重要的作用，是不定根产生的关键
CaMV克隆载体
• 含1个约8kb的环状双链DNA分子； • 用于十字花科和少数非十字花科的植物基
（1）双元载体系统（binary vector） 具有两个质粒——穿梭质粒和Ti质粒。 （2）共整合载体（integrated vector） 共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成 区经过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。
Ri质粒
➢发根农杆菌存在另一种质粒，Ri质粒。 ➢Ri质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。 发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根， 这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称 之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根 或发根，Ri质粒为根诱导质粒。 ➢Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以 分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部 分。
YAC的组成结构
（1）着丝粒区（CEN）
酵母染色体着丝粒区的保守序列: 由三个区组成
I
A
A
GTCACGTG
II 78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
（2）端粒（TEL） 两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
• T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所 以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed) 后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB 至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
• Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的， 毒性基因可以顺式及反式两种方式控制TDNA转移。
3、PAC载体
二、植物载体
Plant cloning vectors
• Ti质粒:侵染广泛的双子叶植物 • T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生
化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。 • 结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复
不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列 (T-DNA border sequence)。去除右边界序列，将使TDNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性 无明显影响。 • 毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。 长度约35kb，和T-DNA处于不同位置
◆ BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的 一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb 的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构 成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA 片段。 ◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常 仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子， 在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本 身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克 隆位点。
（4）克隆位点
位于 SUP4 基因内部。
插入失活选择：
SUP4酶失活的酵 母菌落呈红色； 不失活的菌落是白 色。
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2、细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）
细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）
（2）Vir区（virolence region）
Vir区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗 传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性， 故称之为毒性区。Vir区段总长度大约35kb，由7个互