分类号学校代码１０５４２密级学号２０１００２１２１３６６炔类药物及其代谢物的高效衍生一电喷雾质谱分析Ｈｉｇｈｌｙ—ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｆｏｒＥＳＩ－ＭＳｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｌｋｙｎｙｌｄｒｕｇｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ·…‘研究生姓名指导教师姓名、职称学科专业研究方向朱卫桃郭宾副教授药物分析色谱与药物分析湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一三年五月摘要本文研究的炔类药物是指化学结构中含有炔基基团的化合物，包括人工合成和天然来源药物，如长效雌激素、孕激素、单胺氧化酶抑制剂、烯二炔类抗生素、逆转录酶抑制剂等，在人工避孕、降血糖、抗癌等方面应用较广。
多数炔类药物在服用后的体内代谢过程复杂，其检测难点是含量低、结构多样、基质干扰大，同时又因离子化问题（如炔类激素）Ｉ琨ＮＴ高灵敏度和选择性质谱的运用。
为实现复杂生物基质中炔类药物的有效分析，本论文从分子结构修饰入手，探索新型的样品衍生化策略，进而建立一种高效、专一、灵敏的高效液相色谱．质谱生物体液检测方法，因此在拓展常规质谱检测技术的运用范围上具有重要的方法学意义。
基于炔类药物结构有着相同的炔基基团，本课题利用点击化学反应原理将叠氮化合物与待测物分子环化加成，生成质荷比增大的衍生物离子，不仅提高了分析物在电喷雾质谱中的离子化效率，而且有效降低基质中的杂质干扰；同时该方法具有产率高、副产物少、产物易于分离、反应条件简单等优点，便于对炔类药物的进行定量分析。
这种基于学科交叉优势的新型检测筛选方法很适合“一锅法’’对生物基质中的多种端基炔类激素的同时定量检测和代谢物的定性鉴别。
该方法被成功运用于相关激素类药物及其复杂代谢产物的检测和筛查。
本论文的主要工作如下：１．基于叠氮．炔点击反应的化学原理，首先优化筛选出一种高效的催化剂，以提高反应方法的衍生效率，进而考察和验证不同结构叠氮化合物衍生剂的有效性。
论文以５种端基炔类物质为研究对象考察了强溶剂、溶剂比、反应温度、反应时间、催化剂浓度等条件对目标物离子化效率的影响，并获得最佳点击反应条件。
２．基于上述最佳衍生化条件，建立了复杂生物基质中９种端基炔类激素的点击反应液相．串联质谱分析方法。
重点考察了血清和尿液中点击方法的最佳条件，建立采用“一锅法”对生物基质中的多组分端基炔类激素进行同时点击反应．定量检测，并对方法学的可靠性和实用性进行验证。
３．基于细胞色素Ｐ４５０酶对药物代谢的催化转化，采用人肝微粒体体外代谢系统开展５种激素类药物的代谢转化研究，进一步运用新建的高效液相点击．质谱法对代谢生成的中间产物或代谢物进行筛查，表明该点击反应的衍生化手段特别适用于具有特征质谱碎片的代谢物检测，结合二级质谱离子的特征丢失和裂解行为，可准确识别和发现新型代谢产物，为炔类药物的代谢研究提供新型分析手段。
关键词：炔类药物，点击化学，化学衍生，代谢产物，电喷雾ＩＩＡＢＳＴＲＡＣＴＡｌｋｙｎｙｌｄｒｕｇｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｉｎｔｈｅｐａｐｅｒｒｅｆｅｒｓｔｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓｔｈａｔｃｏｎｔａｉｎａｌｋｙｎｙｌｇｒｏｕｐｓｉｎｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｉｔｉｎｃｌｕｄｅｓｓｙｎｔｈｅｔｉｃｄｒｕｇｓａｎｄｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｓｕｃｈａｓｌｏｎｇ—ｔｅｒｍｅｓｔｒｏｇｅｎ，ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，ｍｏｎｏａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｅｎｅｄｉｙｎｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｗｈｉｃｈａｒｅｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄａｓｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ，ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃａｎｄａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒｏｆｔｈｅｓｅａｇｅｎｔｓ，ｅｔｃ．Ａｆｔｅｒｕｐｔａｋｅ，ｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓｅｓｄｒｕｇｓｉｎｖｉｖｏａｒｅｏｆｔｅｎｃｏｍｐｌｅｘ．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙｄｕｅｔｏｔｈｅｉｒｌｏｗａｎｄｃｏｍｐｌｅｘｍａｔｒｉｘｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．ｃｏｎｔｅｎｔ，ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇｓｔｒｕｃｔｕｒｅＥｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｅｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｂｌｅｍｓ（ｓｕｃｈａｓａｃｅｔｙｌｅｎｅｈｏｒｍｏｎｅ）ｌｉｍｉｔｓｔｈｅａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｏｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅＴｏｉｍｐｌｅｍｅｎｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｃｅｔｙｌｅｎｅｄｒｕｇｓｉｎｃｏｍｐｌｅｘｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ，ｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｄｅｖｅｌｏｐｅｓａｎｅｗｓａｍｐｌｅｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙ，ａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓａｈｉ曲ｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＨＰＬＣ—ＭＳ）ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｌｕｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｕｓｉｔｉｓｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎｅｘｐａｎｄｉｎｇｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｋｙｎｙｌｇｒｏｕｐｉｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｔｈｅｐａｐｅｒｔａｋｅｓａｄｖａｎｔａｇｅｏｆｃｌｉｃｋｃｈｅｍｉｓｔｒｙｒｅａｃｔｉｏｎ，ｕｓｉｎｇａｚｉｄｅｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｏＩＩＩｈｏｒｍｏｎｅｓｉｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｉｔｐｕｔｓｅｍｐｈａｓｉｓｏｎｔｅｓｔｉｎｇｔｈｅｃｌｉｃｋｍｅｔｈｏｄｉｎｓｅｒｕｍａｎｄｕｒｉｎｅａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓｔｈｅ”ｏｎｅ—ｐｏｔｍｅｔｈｏｄ”ｕｓｅｄｉｎｃｌｉｃｋｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｉｓｖａｌｉｄａｔｅｄｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆａｃｅｔｙｌｅｎｅｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄａｌｓｏｔｅｓｔｉｆｅｓｔｈｅｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．３．ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｅｎｚｙｍｅｓｉｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｔｈｅａｕｔｈｏｒｄｏｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｏｆｆｉｖｅｈｏｒｍｏｎｅｄｒｕｇｓｂｙｕｓｉｎｇｖｉｔｒｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓｙｓｔｅｍｏｆｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｏｒｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｔｈｅ。
ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｒｅｓｒｅｅｎｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｈｅｌｐｏｆｎｅｗｌｙ－ｂｕｌｉｔｍｅｔｈｏｄｏｆｃｌｉｃｋ．ｂａｓｅｄＨＰＬＣ－ＭＳ，ｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔｔｈｅｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｌｉｃｋｒｅａｃｔｉｏｎｉｓｑｕｉｔｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｔｅｓｔｏｎｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｂｙｕｓｅｏｆｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＴｈｅｃｌｉｃｋｒｅａｃｔｉｏｎＣａｎｃｏｒｒｅｃｔｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｔｈｅｎｅｗｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｅｃｏｎｄａｒｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｕｍｉｏｎｓ．Ｔｈｕｓｉｔｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｗａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆａｃｅｔｙｌｅｎｅｄｒｕｇｓ．ＫｅｙＷｏｒｄｓ：ａｌｋｙｎｙｌｄｒｕｇｓ，ｃｌｉｃｋｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｆｉｖｍｉｏｎ，ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＶ目录摘要………………………………………………………………………．ＩＡＢＳＴＲＡＣＴ…………………………………………………………………………………ＩＩＩ第一章绪论……………………………………………………………．．１１．１点击反应的简述……………………………………………………．．１１．２高效液相一电喷雾．质谱分析法简述……………………………．３１．３炔类药物的检测及代谢物的检测简介…………………………５１．４本论文的研究意义………………………………………………７第二章炔类物质点击反应方法的研究………………………………９２．１引言…………………………………………………………………………………．．９２．２实验部分…………………………………………………………．．９２．３结果与讨论………………………………………………………．１４２．４结论…………………………………………………………………………………１９第三章液相一串联质谱法对生物基质中９种端基炔类激素的点击反应检测……………………………………………………………………………………………．２０３．１前言…………………………………………………………………………………２０３．２实验部分…………………………………………………………２０３．３结果与讨论…………………………………………………………２４３．４小结…………………………………………………………………………………３７第四章端基炔类激素代谢物灵敏筛选…………………………………４２４．１前言…………………………………………………………………………………４２４．２实验部分………………………………………………………………４２硕士学位论文１．１．２点击化学的应用１．１．２．１先导化合物库的建立炔基化合物与叠氮化合物的加成产物具有Ｎ杂环结构，因此可以通过带有炔基或叠氮基的简单序列合成一系列结构复杂的、多样性的先导化合物库。
如Ｅｉｃｈｌｅｒ等【６】通过Ｈｕｉｓｇｅｎｌ，３．偶极环加成反应来组装缩氨酸的分子架，从而制得种类多的缩氨酸的组合化合物库。
Ｔｈｏｒｓｏｎ等【７】利用点击反应生成的具有类似天然产物性能的万古霉素，这些抗生素类似物可供临床使用。
美国Ｃｏｅｌａｃａｎｔｈ公司利用液相点击方法合成了２０００００个单体化合物，这些单体化合物的纯度都达到８５％以上，引起很大的关注。
１．１．２．２原位点击化学目前原位点击化学用来合成天然化合物以及对传统药物合成和进一步筛选方面取得很大的进展。
它依靠酶为反应模板，选择性连接各模块组分，因此能合成酶自身的抑制剂。