瘤胃体外发酵方法绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰1.2瘤胃液的采集和培养基制备瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料(精料组成,玉米:豆粕=2:1),自由饮用清洁水。
于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:2混合,在39℃培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。
每升培养基中含有15.71mg CaCl2·2H2O,11.90mg MnCl2·4H2O, 1.19mg CoCl2·6H2O, 9.52mg Fe Cl3·6H2O, 0.143g MgSO4·7H2O, 76.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S·9H2O和0.298g盐酸半肌胺(Menke等,1979)1.3试验设计试验根据绞股蓝皂试添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。
取60mL瘤胃液与培养基混合液(瘤胃液:培养基二1:2)分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物"底物由精料和粗饲料组成(3:7),精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉(过1mm筛)。
发酵瓶封盖!气压平衡后置于39℃培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。
第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。
1.4指标测定1.4.1产气量的测定根据Theodorou等(1994)的方法,使用气压转换器(IGER,UK)定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。
根据各产气量和气压进行校正,除去空白发酵瓶产气量,计算出累积产气量。
4.3挥发性脂肪酸的测定取发酵液样品lmL加25%偏磷酸和巴豆酸(内标法,100mL溶液中含巴豆酸0.6464g)混合液0.2mL,-20℃冰箱保存。
测定前解冻,12,000rpm离心lomin,取上清液0.6uL测定。
优化胡伟莲方法测定VFA(胡伟莲,2005),柱温130℃,进样器温度为180℃,检测器温度为180℃)。
高纯氮总流量30.2mL/min,柱流l.7mL/min,氢气流量40mL/min,空气流量4O0mL/min。
4.4氨态氮浓度测定将样品与0.2N盐酸等体积混合,于-20℃保存。
测定前解冻,于4℃条件下,10,000rpm离心l0min,取上清液采用比色法进行测定分析(weatherburn,1967)"4.5微生物蛋白浓度测定取瘤胃内容物7ml保存在-20℃冰箱"测定前解冻,取3ml混匀样品在1,000rpm/min,离心8分钟去除原虫和饲料残渣。
取2ml上清液在25,000Xg离心20分钟(Makkar等,1982)。
取10ul上清液加入到5ml考马斯亮蓝溶液中,在595nm波长下读取吸光度值,以牛血清蛋白为标准溶液计算样品微生物蛋白含量。
1.4.6原虫计数将混匀发酵液4层纱布过滤后与9%甲醛等比例混合避光保存,用改装的血细胞计数板计数。
改装后计数板的计数室高度为0.25mm,以确保较大体积原虫也能被计数(Newbold 等,1987。
4.7氢的还原力根据Demeyer(1991)挥发性脂肪酸和CH4产量计算,计算公式:2Hr(%)=(4M+2P+2B)*100/(1A+P+4B)其中,A,乙酸;P,丙酸;B,丁酸;M,C执(以上均为净摩尔产量)。
对瘤胃微生物发酵参数的影响1材料与方法1.1试验动物、日粮组成与试验设计试验动物为4只1岁左右、体重在30士2.3kg波尔山羊与本地山羊杂交的一岁阉公羊采用4x4拉丁方设计,日粮组成为70%的羊草,20%的玉米及10%的豆粕(代谢能,2742.5kcal/kg;粗蛋白,12.96%;粗纤维,22.33%)。
每期为16天,适应期H天,采样时间为5天,共4期。
两次于8:00和17:00点等量瘤胃灌注。
对照组以与试验组相同体积生理盐水灌注,自由饮用清洁水。
2样品采集与分析饲料采食量分别在每期的11-13天测定。
记录每日饲料添加量和剩余料量,以干物质为基础计算采食量"饲喂后第14天,分别在采食前0h和采食后2,4和8h利用负压通过瘤胃痰管采集瘤胃内容物,用四层纱布过滤去除大的饲料残渣后,迅速测定瘤胃内容物的pH值,将过滤后瘤胃液分成4份。
取上述过滤的瘤胃液一份,将瘤胃液与25%偏磷酸溶液按5:1比例进行混合-20℃冷冻保存,以备vFA测定(Jouany,1982),其中25%的偏磷酸溶液中含有6.4g/l的巴豆酸(内标测定vFA)(Cottyn和Boucque,1968).冷冻瘤胃液解冻后于12,ooo×g/min在4℃条件下离心l0min,取上清液0.6u上气相测定vFA含量。
气相色谱仪(岛津,GC-14B,日本)具有氢离子火焰检测器,毛细柱为No.34292-07B,30m×0.32rnm×0.25四膜(Supelco,美国)。
汽化室温度为180℃,柱温135℃,检测室温度180℃，高纯氮总流量30.2mL/min,柱流1.7mL/min,氢气流量40mL/ min,空气流量400mL/ min。
根据Demeyer(1991)的方程计算CH4产量和氢利用率。
方程如下:瘤胃可发酵有机物(FOM)gmol-1 vFA=162(0.5A+0.5P+B) vCH4产量(Lkg-1FOM)=(1.8A一l.1P+l.61B)×l000×22.4(4×v)2Hr(%)=(4M+2P+2B)×100/(2A+P+4B),其中A,乙酸;B,丁酸;P,丙酸;M,CH4。
.以上均为净摩尔数。
第二份取4ml瘤胃液样品加入等量的0.2mol/L的盐酸-20℃冷冻,用比色法测定氨态氮浓度,波长为625nm。
样品解冻后在4℃条件下15,000×g离心15min,上清液用来测定氨态氮浓度(Chaney,1962)"第三份取7ml样品-20℃保存用于微生物蛋白的测定"室温解冻,取3ml混匀样品,1,000r/min离心8min除去原虫和饲料残渣.取上清液2ml在25,000×g离心20min,去除上清液,沉淀中加入0.5mL0.25N氢氧化钠溶液,100℃煮沸10min，取100ul上清液加入到5ml 考马斯亮蓝溶液中,在595nm条件下比色读取吸光度值。
以结晶牛血清白蛋白为标准品做标准曲线计算样品微生物蛋白含量。
对原虫、产甲烷菌及细菌区系的影响1材料与方法1.1动物、试验设计及采样同本章第一节。
1.2用于原虫PCR/DGGE分析的样品保存及引物比较比较-20℃冷冻保存和液氮保存PCR/DGGE的样品效果及两对常用瘤胃原虫PCR/ DGGE 引物的筛选.2.1实验动物和瘤胃内容物的收集随机选取4只(A、B、C和D)装有永久性瘤胃瘩管的波尔山羊与本地山羊杂交后代,自由采食全粗料。
实验期间分别于饲喂前0h和饲喂后1、2、4和8h从山羊瘤胃采集瘤胃内容物,4层纱布过滤,迅速投入液氮和-20℃保存以备瘤胃微生物基因组DNA的提取。
1.2.2瘤胃内容物总DNA的提取参照Zoetendal等(1998)方法,将液氮和-20℃保存样品室温解冻,取解冻后混匀的瘤胃内容物样品1.smL,珠磨法机械破碎内容物后,用酚和氯仿/异戊醇提取瘤胃内容物总DNA。
1.2.3PCR扩增反应以瘤胃内容物总DNA为模板,两对原虫特异性引物进行比较,对原虫的185rRNA进行特异PCR扩增扩增"引物序列见表2-2。
1.3山羊瘤胃微生物基因组DNA提取本章第一节所采集瘤胃液样品迅速保存在液氮中以备基因组DNA提取（DNA提取效果优于冷冻,见原虫DGGE方法优化部分)(Zoetendal等,1998)。
所提取基因组DNA用于原虫、细菌和产甲烷菌区系及微生物的定量分析。
1.4瘤胃微生物的DGGE引物表2-2试验中使用的PCR引物Table 2-2 The primers used in the experiment使用特异的原虫、细菌和产甲烷菌DGGE引物(表2-2)扩增原虫18srDNA、细菌和产甲烷菌16srDNA。
使用Bio-Rad Dcode系统进行DGGE电泳,8%的丙烯酸胺溶液制成30-50%的梯度凝胶对原虫区系分析,8%的丙烯酞胺溶液制成38-53%的梯度凝胶对细菌区系分析,6%的丙烯酞胺溶液制成30-70%的梯度凝胶对产甲烷菌区系分析。
先200V预电泳10min,然后85V电泳16h。
对DGGE胶进行银染(Muyzer,1993)。
DGGE胶上主要的和特异的条带用洁净的刀片和枪头切下移入。
1.5ml离心管中,37℃或室温过夜再进行PCR扩增,纯化PCR产物后测序,在GenBank上比对寻找最相似菌。
对山羊瘤胃微生物数量的影响1材料与方法1.1试验设计本章第一节山羊在体试验不同时间点的DNA样品进行分析研究,以山羊瘤胃总细菌为参照,对瘤胃中methanogens,fungi,R.flavefaciens和F.succinogenes的相对数量进行定量分析。
1.2仪器设备!试剂与耗材实时定量PCR仪(ABI7300,美国)如图2-12。
实时定量PCR反应采用SYBR Green染料法,荧光染料预混试剂为SYBR Green Realtime PCR master Mix with ROX(TOYOBO,Japan)。
实时定量PCR反应在八联管上进行(Axgen,USA)表2-4 定量PCR引物Table 2-4 PCR Primers for qPCR assay1.3原虫计数取瘤胃液与等量9%的甲醛溶液混合,于4℃保存用于原虫计数。
样品需进一步稀释以便于计数,原虫总数和五种原虫在显微镜下计数(Newbold,1987)。
为保证所有个体大小不同原虫都能被准确计数,对计数板进行了改装,使计数室高度增加为0.25mm。
1.4定量PCR反应体系与扩增条件使用上述DNA样品对瘤胃微生物进行了定量分析(如总菌,真菌,产甲烷菌,黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌),以上微生物的特异性引物见表2-4(Denman等,2006)。
使用荧光染料SYBR Green进行标记,使用瘤胃微生物特异性引物,对微生物进行PCR扩增,根据定量PCR 的循环数对微生物进行相对定量分析(ABI 7300,USA)(Denman等,2006;Chen等,2008)。