单克隆抗体的制备1975年，Köhler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体，单克隆抗体具有特异性高，灵敏度高，重复性好，可供应量大，检测时间短以及能够查出混合物中的少量成分等优点。

1试验材料1.1试验动物和细胞雌性6～8周龄BALB/c小鼠SP2/0骨髓瘤细胞1.2主要实验试剂HRP标记羊抗小鼠IgG、福氏完全佐剂（FCA）、福氏不完全佐剂（FIA）、聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜（DMSO）、降植烷、TMB底物、HAT(50×)、HT(50×)、三抗溶液（100×）小鼠单抗Ig类和亚类鉴定用ELISA试剂盒均为SIGMA公司；DMEM粉、特级胎牛血清（FBS）均为GIBCO公司；牛血清白蛋白（BSA）1.3主要实验仪器和耗材CO2细胞培养箱（Thermo和上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-160B-Ⅲ）酶联检测仪（BIO-RAD Model 680）血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）pH计（Sartorius赛多利斯科学仪器）APL高压灭菌锅（CL-32L）生物安全柜(ESCO北京五州东方科技发展有限公司)三恒电泳仪（JY600C）数显恒温磁力搅拌器（78HW-1，杭州仪表电机有限公司）电子分析天平（Sartorius赛多利斯科学仪器）分光光度计（WPA Biowav eⅡ+）进口液氮罐（Thermo）Protein A柱恒温水浴锅（HH-2金坛市科兴仪器厂）微型台式真空泵（GL-80ZB型，海门市）电热恒温培养箱（DHP-9032上海天恒医疗器械）低速离心机 (L-550长沙湘仪离心机仪器有限公司)高速冷冻离心机（SIGMA 2-16PK）倒置显微镜（Nikon TS100）超低温冰箱(Thermo)96孔酶标板（）96孔、24孔细胞培养板、T25培养瓶、35mm培养皿、60mm培养皿、100mm培养皿、冻存管0.22μm过滤器(PALL)2主要试剂配制2.1常规试剂配制PBS（或PB）（0.02mol/L，pH7.4）：A液（0.2 mol/L Na2HPO4）：Na2HPO4·12H2O 71.64g,加蒸馏水至1000ml；B液（0.2 mol/L NaH2PO4）：NaH2PO4·2H2O 3.12g,加蒸馏水至1000ml；取A液81ml加B液19ml混合，再用生理盐水（或蒸馏水）做10倍稀释即成。

饱和硫酸铵溶液（pH7.4）：称取80~85g A·R级(NH4)2SO4，以50~80℃蒸馏水100ml溶解，搅拌20min，趁热过滤。

冷却后以浓氨水（15N NH4OH）调pH至7.4。

配好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。

取饱和硫酸铵40ml，加蒸馏水60ml稀释即成40%饱和硫酸铵。

2.2细胞融合试剂配制DMEM不完全培养基：DMEM粉1袋，3.7g NaHCO3，用1mol/L HCl调pH至7.2-7.3，加灭菌超纯水定容至1000ml。

0.22μm滤膜过滤除菌至1L试剂瓶中，4℃保存。

胎牛血清（FBS）的灭活：56℃，灭活30min，分装100ml或50ml一瓶，-20℃冻存。

10%FBS完全培养基：FBS 10ml，DMEM不完全培养基90ml，三抗溶液1ml，4℃保存。

20%FBS完全培养基：FBS 20ml，DMEM不完全培养基80ml，三抗溶液1ml，4℃保存。

HAT培养基：20%FBS培养基98ml，HAT（50×）贮存液2ml。

HT培养基：20%FBS培养基98ml，HT（50×）贮存液2ml。

冻存液：完全培养基:DMSO=9.2:0.8，即含8%DMSO，与培养过程中使用的血清保持一致，需新鲜配制。

2.3ELISA试剂配制(1) PBS 10×stock solution40g Na2HPO4·12H2O5g KH2PO481g NaCl1.0mL 20% NaN3 (20g NaN3溶解在100mL蒸馏水中)用蒸馏水溶解，定容到1L。

(2) Coating buffer1.59g Na2CO32.93g NaHCO31.0mL 20% NaN3用800mL蒸馏水溶解，调pH到9.6，定容到1L。

(3) Blocking buffer将0.5gBSA 溶解在100mL Coating buffer 中（即0.5%BSA溶液）。

(4) Tween buffer100mL PBS 10×stock solution5g BSA0.5mL Tween 201.0mL 20% NaN3用800mL蒸馏水溶解，定容到1L。

(5) Tween wash buffer45g NaCl2.5mL Tween 20用足量蒸馏水溶解，定容到5L。

(6) Enzyme substrate buffer97mL Diethanolamine（乙二醇胺）700mL 蒸馏水1.0mL 20% NaN3用大约100mL 1M浓盐酸调pH到9.8，然后加101mg MgCl2·H2O（相当于181.4mgMgCl2·12H2O），最后定容到1L。

(7) Substrate（现用现配）将1个NPP药片溶解在5mL Enzyme substrate buffer中，黑暗条件下保存。

（8）OPD底物缓冲液：0.2M Na2HPO4 25.7ml0.1M 柠檬酸 24.3ml加蒸馏水 50ml，pH 5.0（9）OPD底物（现配先用）OPD工作液配制：10ml底物缓冲液中加入5mg OPD，完全混匀后加H2O2(浓度30%)4µl/10ml即可，100µl/孔，492 nm的波长读数。

2.4SDS-PAGE试剂配制30%聚丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺，1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，充分溶解后过滤，调pH7.0，4℃棕色瓶保存备用。

分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：18.17g Tris碱，加蒸馏水约80ml，用浓盐酸调pH至8.8，加蒸馏水定容至100ml。

浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）：12.11g Tris碱，加蒸馏水约80ml，用浓盐酸调pH至6.8，加蒸馏水定容至100ml。

10%（w/v）SDS溶液：10g SDS，加蒸馏水定容至100ml。

10%（w/v）过硫酸铵：1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解，300μl/支分装-20℃冻存。

2×上样缓冲液：4%（w/v）SDS，2%（w/v）β-巯基乙醇，20%（v/v）甘油，0.2%（w/v）溴酚蓝，溶于0.1mol/L Tris-HCl（pH6.8）中。

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1gTris碱，72g甘氨酸，5g SDS，溶于1000ml 蒸馏水中。

考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250溶解于100ml甲醇、水、冰乙酸（9:9:2）混合物中，过滤除去未容物。

脱色液：甲醇:水:冰乙酸=1:7:2的混合物。

3试验方法单克隆抗体制备技术路线如图1-1。

3.1动物免疫根据常用免疫学实验技术，采用搅拌混合法，将100μg/ml的400μl抗原溶液与等体积的400μl佐剂充分混合，最终形成“油包水”的乳化状态。

初次免疫：用FCA乳化后，每只鼠打4针（腋下腹股沟淋巴结丰富处）每针0.2 ml，即免疫抗原剂量为每只40μg；3周后第二次免疫：用FIA乳化，剂量针数同上；3周后第三次免疫：不加佐剂直接腹腔注射，剂量同上。

三免后10d分别尾静脉采血，采用ELISA间接法测其效价，未达到效价要求的继续按三免方式每隔两周免疫一次，直至效价达到1：105。

融合前3d加强免疫：50μg OV A抗原量，腹腔注射，3d后取脾融合。

图1-1单克隆抗体制备技术路线图3.2小鼠血清效价的测定3.2.1包被抗原和酶标二抗的最适浓度以高纯度的抗原包被酶标板，包被浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml，阳性对照取抗原蛋白免疫后小鼠血清作1:100、1:1000和1:10000稀释，阴性对照取未免疫的小鼠血清作1:100稀释，空白对照采用样品稀释液，HRP标记羊抗小鼠IgG分别稀释成1:1000、1:2500、1:5000、1:7500和1:10000。

检测结果中以空白对照值相对最小、阴性值与空白值之差小于0.1、以及阴阳性差别相对最大的包被抗原浓度和酶标二抗抗体稀释度为最适条件。

3.2.2小鼠血清效价的检测采用间接ELISA法测定小鼠血清效价。

小鼠尾静脉采血0.1ml，37℃放半小时后，在4℃过夜，4℃ 5000r/min离心10min，收集血清，用间接ELISA法检测血清效价，同时设阴性和空白对照。

间接ELISA法程序如下：1）包被：用包被液稀释OV A抗原，使浓度达到10μg/ml，以100μl/孔包被酶标板，置4℃过夜。

2）洗板：弃去酶标板孔内液体，用PBST洗涤三次，每次30min，拍干。

3）封闭：每孔加100μl封闭液封闭游离结合位点，37℃湿盒温育1h，洗板同上。

4）加待测样品：用样品稀释液适当稀释待检血清，阴性对照为同批正常鼠血清（100倍稀释），空白对照为样品稀释液，每孔加100μl，37℃湿盒温育1h，洗板同上。

5）加酶标二抗：将HRP标记羊抗小鼠IgG按1:5000稀释，每孔加100μl，需新鲜配制，37℃湿盒温育1h，用PBST洗涤6次，拍干。

6）显色：各孔加TMB底物液100μl，室温避光反应10min。

7）终止：各孔加50μl终止液终止反应。

8）读数：用酶联检测仪在450 nm波长处测定OD450值。

3.3杂交瘤细胞株的建立3.3.1饲养细胞的制备取未免疫的BALB/c小鼠眼动脉采血后拉颈处死，分离血清作为抗体检测时的阴性对照血清，-20℃冻存备用。

将小鼠尸体浸泡于75%酒清中5min，无菌条件下剪开腹部皮肤后撕开暴露出腹膜，在腹膜开一小口，用DMEM不完全培养基约10ml反复冲洗腹腔并收集巨噬细胞，放入50ml离心管，1000r/min离心10min，弃上清，用HAT培养基重悬细胞并计数，调整浓度在2×105/ ml左右。

将含腹腔巨噬细胞的培养液加入到4块96孔板内，每孔100μl（约两滴）。

放入37℃ 5%CO2培养箱内培养，24h后融合使用。

3.3.2SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备在融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞并扩大培养，骨髓瘤细胞生长快通常以1:10传代，使用10%FBS完全培养基培养，调整好细胞状态。

融合前12h需要换液一次，使大多数细胞在融合时处于对数生长期，细胞浑圆透亮、圆亮、形态均一，排列整齐，成半致密分布。