实验一载体与目的基因的连接与转化以及
重组DNA的提取与酶切鉴定
一、实验目的
1.CaCl2法制备感受态细胞
2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）
3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r）
4.质粒DNA的小量快速制备
5.质粒DNA的限制性内切酶酶切
6.DNA的琼脂糖凝胶电泳
二、实验原理
通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。
受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。
由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。
分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。
SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH＞12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。
当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。
通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。
三、实验器材和试剂
１.器材
恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培
养管、电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。
2.试剂
1）用BamH I和Xba I处理的线状pSV质粒DNA（20 ng/ul）
2）用BamH I和Xba I处理的4.8 kb c-myc DNA片段（20 ng/ul）
3）已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA（5 ng/ul）
4）T4 DNA连接酶（5 U/ul）及10×连接酶缓冲液（Thermo公司）
5）LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板（含抗生素）
6）0.1 mol/L CaCl2溶液
7）AxyPrep质粒DNA小量试剂盒（Axygen公司产品）
8）无水乙醇
9）BamH I（10 ug/ul）及Xbal I（10 ug/ul）（NEB公司产品）
10）10×Buffer 4（NEB公司产品）
11）1×TAE（0.04 mol/L Tris-乙酸；0.001 mol/L EDTA）
12）γDNA Hind III Markers（0.1 ug/ul）（Thermo公司）
13）6×凝胶加样缓冲液（0.25%溴酚蓝；40%（w/v）蔗糖水溶液）
14）氨苄青霉素储存液（100 mg/ml）
15）CelRed核酸染料（10000×in water）（Biotium公司产品）
四、实验步骤
1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接
目的基因片段（4.8 kb），25 ng/ul 4 ul
载体DNA（3.5 kb），25 ng/ul 4 ul
10×buffer 1 ul
T4 DNA连接酶（5 U/ul）0.5 ul
ddH2O 0.5 ul
总体积：10 ul
混匀，16℃水浴锅温浴
2. CaCl2法制备感受态细胞
1）取0.1 ml大肠杆菌HB101培养物，加至3 ml LB培养液中，37℃振摇约2 h，细胞长至云雾状。
2）将细胞悬液倒入15 ml离心管，冰浴10 min。
3）4℃，4000 rpm，离心10 min。
4）去上清，在纸巾上倒置1 min。
5）沉淀重悬于冰预冷的1 ml CaCl2（0.1 mol/L），混匀。
6）转入1.5 ml离心管，冰浴10 min。
7）4℃，4000 rpm，离心10 min。
8）去上清，在纸巾上倒置1 min，重悬于120 ul CaCl2（0.1 mol/L），分装为50 ul/管。
3.重组质粒转化感受态细胞
1）5 ul连接产物或阳性对照1 ul分别加入50 ul感受态细胞，冰浴30 min。
2）42℃，90 sec。
3）立即冰浴1~2 min。
4）分别加入LB培养液150 ul，37℃振摇45 min。
5）分别取200 ul实验组和100 ul对照组铺板于含Amp的LB平板。
6）37℃温箱培养过夜。
4.重组质粒的提取
1）将细菌培养物全部倒入15 ml离心管，4500 rpm，5 min，去上清，沥干。
2）加入250 ul Buffer S1，吹打混匀以充分悬浮细胞，转入1.5 ml离心管。
3）加入250 ul Buffer S2，上下颠倒，温和混匀4~6次使菌体裂解。
4）加入350 ul Buffer S3，上下颠倒，温和混匀6~8次，12000 g离心10 min。
5）吸取上清至已置于2 ml离心管的制备管中，12000 g离心1 min，去滤液。
6）同上，在制备管中加500 ul Buffer W1，12000 g离心1 min，去滤液。
7）在制备管中加入700 ul Buffer W2，12000 g离心1 min，去滤液。
8）重复步骤7）一次，再空离心1次。
9）将制备管移入新的1.5 ml离心管，在膜中央加60 ul Eluent或ddH2O（65℃温浴），室温静置1 min，12000 g离心1 min，即为质粒DNA。
、
5.质粒DNA的限制性内切酶酶切
Buffer 4 2 ul
BamH I（20 U/ul） 1 ul
Xba I（20 U/ul） 1 ul
ddH2O 10 ul
质粒DNA 6 ul
总体积：20 ul
混匀后短暂离心，37℃水浴1 h。
6.凝胶电泳
1）准备好制胶器，插好梳子并保证梳子距底部0.5 mm~1.2 mm。
2）准备好凝胶，加热溶解。
3）加入GelRed，灌胶，待凝。
4）在电泳槽内加入电泳缓冲液，拔去加样梳，将制好的凝胶连同内架放入电泳槽内，保证液面高于凝胶面。
5）加入6×凝胶加样缓冲液和DNA（1：5混合）。
6）依次加样品以及Marker。
7）连通电源，80~100 V电泳至溴酚蓝带到达凝胶1/2处。
8）结果观察和记录。
五、实验结果
1.平板观察
次日取平板观察，可见平板中有单克隆菌落生长，说明转化成功。
将平板于4℃冰箱保存备用。
A B
图1 平板克隆生长情况 A.实验组；B.对照组
2.酶切及电泳结果
电泳结果显示：转化后获得的质粒分子量月8.5 kb，双酶切后获得两端分子量分别为3.5 kb和4.8 kb的片段，与预期结果一致。
该结果表明重组DNA构建成功。
图2 凝胶电泳结果，样品顺序依次为第四组未酶切质粒，双酶切质粒，Marker，第十一组未酶切质粒以及双酶切质粒
六、实验注意事项
1.制备感受态细菌的过程中必须全称保持在冰浴中进行。
这是由于低温可以使细胞膜的流动性降低，有利于DNA的结合，同时使细胞暂停生长，维持在对数生长期的高活性。
2.细菌培养时需将平板倒置。
这是由于培养基中的水分含量较高，在温度较高时容易挥发造成培养基损失，同时，倒置也可以防止蒸发的水分在培养皿盖子上凝结并滴落下来，影响菌落生长。
3.在质粒抽提时，DNA变性复性的过程中，动作要温和轻柔，避免剧烈摇晃。
这是为了防止剧烈摇晃导致剪切力过大，使得染色质DNA以及质粒DNA断裂。
4.在凝胶电泳时，确保每样试剂加入反应体系，加样完成后需混匀并短暂离心，再加凝胶加样缓冲液。
电泳时确保电泳的方向不能弄错，DNA从阴极跑向阳极。
七、实验讨论
在本次实验中，我们通过质粒连接、转化、扩增、抽提获得目的重组DNA，并通过酶切、凝胶电泳实验初步验证了重组DNA及酶切片段的大小。
在连接的过程中，温度保持在16℃，而酶切的过程则保持在37℃。
这是由于较低的温度可以使连接产物的分子结构更加稳定，使连接的效率增加；而37℃是内切酶的最佳酶活性温度，保持37℃可以确保酶切的效率最大化。
在酶切验证这一步，我们选取BamH I和Xba I将重组DNA重新切割为原来连接的两个DNA片段，由于我们在连接时选用的是不同的酶切位点酶切的片段，两端具有不同的粘末端，因而连接的方向是确定的，因此当DNA大小与预期一
致时，便可以验证我们的重组DNA是否成功。
若连接用的DNA片段具有相同的粘末端序列，则可能出现载体或目的基因自我连接，以及目的基因在载体中插入的方向相反等情况，通过平板的抗性筛选可以将目的基因自我连接的部分去除，因为其上不含抗性基因，而载体自我连接的DNA可以通过凝胶电泳的分子质量大小区分。
而目的基因片段连接方向的确定则需要设计新的酶切位点，通过选取载体或目的基因上偏离中心位点的位置进行酶切，从而获得理论上正向插入与反向插入获得大小不同的基因片段，并进行酶切、凝胶电泳验证。
凝胶电泳可以初步验证我们获得的重组基因是否正确连接，若需进一步验证重组DNA的序列是否正确，还需要测序鉴定，以及通过转染实验验证目的蛋白是否能够正确表达。