血小板聚集仪中文操作手册第一章原理和功能介绍一、综述血管损伤后，血小板黏附于血血管的损伤处，聚集、合成前列腺素，释放5-羟色氨、ADP、ATP。

前列腺素的合成与释放产物会引起更进一步的聚集。

同时血浆凝固开始、凝血酶产生、纤维蛋白形成和血小板栓子堵塞损伤的血管。

由于细胞膜糖蛋白、细胞内存储颗粒、血小板酶血浆凝血因子缺乏常引起过量出血，常见的临床表现为：鼻衄、损伤、擦伤失血过多。

另外，外科手术的患者尽管经常存在血小板功能障碍，但经常到出血不止或术后出血不止才能发现。

在1962年，Born描述了用ADP诱导的血小板聚集并/改革用比浊计测量富血小板血浆的聚集过程。

这种改变包括：预温37度，搅拌和用记录笔记录一定时间内透过光的变化。

在1977年，Feinman设计了一台仪器，同时测量血小板聚集和ATP释放。

这台仪器利用紫外光测量聚集，在聚集光路的的右侧放置敏感的光度计，通过荧光的产生测量ATP 的释放。

在1980年，Cardinal和Flower设计了电阻法测量全血中的聚集，非常小的电流通过两个电极，当电极刚与血接触时，在其表面会附着一层血小板，当聚集剂加入后，更多的血小板会聚集在其表面，引起电阻增加。

电阻法的测量又构成了一台全血荧光聚集仪。

在1984年，Wojenman和Slier设计了一种快速的方法去进行常规实验室的操作。

这种方法就是同时测量聚集和ATP的释放，用血量为5ml，30分钟内完成检测。

这种方法避免富血小板血浆的准备时间。

在1985年johnson创造了一种方法去检测洗涤血小板的钙流，这种方法有利于研究钙离子在血小板聚集中的作用。

二、血小板聚集仪的功能-----定量血小板的功能缺陷：粘附缺陷von Willebrand disease—定量或定性血浆内vWF因子的缺乏，Bernard-Soulier Syndrome-伯-苏综合症（BBS）亦称巨血小板综合症缺乏血小板膜糖蛋白Ib（GPIb）聚集缺陷Afibrinogenemia-纤维蛋白原缺乏血症Glanzmann’s Thrombasthenia-苏格茨曼血小板功能不全缺乏膜糖蛋白IIb-IIIa血小板颗粒释放缺陷储存池缺陷（SPD）-致密颗粒内容物缺陷Gray platelet syndrome-α颗粒内容物缺陷（PF4、vWF、血小板反应素、促血小板生长因子PDGF）花生四稀酸代谢异常血小板膜花生四稀酸释放缺陷环氧化酶缺陷血栓素酶合成缺陷正常颗粒内容物和花生四稀酸代谢途径释放异常胞内钙流缺陷早期反应缺陷-肌球蛋白轻链磷酸化，磷脂酰肌醇代谢对特异诱导剂的受体缺陷或受体受阻（包括巨血小板综合症和血小板无力症）肾上腺素受体缺乏-脊髓增生混乱（MPD）胶原受体缺乏U46，619药物缺陷-血栓素A2类似物血小板凝集活性缺陷-血小板构成凝块的骨架三、原理血小板聚集是指血小板相互粘附的过程。

当一定数量的诱导剂存在时，血小板在各种情况下均能发生聚集现象。

因此在富血小板血浆中或全血加入诱导剂即可检测血小板的聚集功能。

血小板的聚集依赖钙离子、纤维蛋白原、一个或多个血浆因子及诱导剂的存在，对于不同的诱导剂、不同的诱导剂浓度血小板聚集各异。

在光学法检测血小板聚集时常用ADP、肾上腺素、胶原、瑞氏托酶素等诱导剂进行监测，并为临床诊断提供直接信息。

试剂选择的理论基础：血小板的储存颗粒内含有ADP和肾上腺素，在初级血栓形成时从储存颗粒内释放，诱导进一步的聚集。

实验证明，体外血小板对诱导剂的反应有助于诊断出血性疾患的本质。

血小板内无胶原的存在，但见于血管壁的结缔组织中，所以胶原被认为是第一步聚集或为血小板与血管壁接触的前期因子。

因此体外研究血小板对胶原的反应具有重要意义。

其他的试剂如：凝血酶、A23187钙离子载体、花生四稀酸、瑞氏托酶素、Ⅷ因子、5-羟色氨也应用于不同目的。

血小板聚集是目前能获得检测血小板功能最有效的实验。

血小板聚集仪能帮助诊断、选择正确治疗方案。

血小板聚集仪在诊断遗传性或获得性血小板功能缺陷时具有重要意义。

血小板对不同诱导剂的反应是诊断血小板功能缺陷的基础。

如下表；四．光学法聚集与电阻法聚集的比较PRP-富血小板血浆全血聚集1.将静脉血1000转/分离心10分钟， 1.用等量盐水稀释获得PRP。

2.离心剩下红细胞3000转/20分获得PPP。

2.加入1000ul稀释的标本到反应杯3.用PPP调整PRP中的血小板数为3X108/ml4.加入500ul标本到反应杯中。

所需时间45分钟所需时间5分钟总结1、电阻法聚集不但可应用于全血，亦可应用于PRP2、电阻法聚集不引起聚集波的震荡，因为在光学聚集中磁棒会干扰光的透过3、电阻法聚集与光学法聚集具有一致性的结果4、在全血中聚集与PRP聚集相比应较慢，这是由于红细胞存在降低了血小板间的相互作用5、全血中血小板会保存更长时间电阻法与光学法特点比较：第二章血小板聚集试剂水用于复溶剂，要求为无离子和保护剂如：乙醇会抑制聚集和释放生理盐水用于复溶剂，要求为无离子和保护剂如：乙醇会抑制聚集和释放collagen-胶原货号：385保存浓度：1mg/ml使用浓度：2μg/ml试剂保存：未开封2-8℃保存至效期开封后的试剂分装稳定期为1个星期2-8℃使用方法：全血标本：2μL的试剂到1ml的样本中，终浓度为2μg/mlPRP：加1μL的试剂到500μL的样本中，终浓度为2μg/ml正常和ATP释放使用的浓度为2-5μg/mlArachidonic Acid：花生四稀酸货号：390成分：99%花生四稀酸和100mg白蛋白保存浓度： 50mM/L使用浓度： 50mM/L试剂的准备：加入1ml的生理盐水到白蛋白内，至少放置15-30分钟直到完全溶解。

花生四稀酸为油滴状物，务必将此试剂沉至瓶底后加入0.7ml溶解的白蛋白，轻轻混合。

复溶后的花生四稀酸悬液应呈奶状并带有小气泡,加入10uL到1mL标本中最终浓度为0.5mM。

试剂使用前一定要充分混匀。

试剂保存：未开封白蛋白：2-8℃保存至效期花生四稀酸：-20℃以下冰冻保存至效期复溶后：1、试剂需分装在-70℃，暗处保存3个月2、-20℃，在暗处冰冻保存1个月工作中保存：在阴暗处2-8℃保存8个小时使用方法：全血标本：加10μL的试剂到1ml的样本中，终浓度为0.5mM PRP：加5μL的试剂到500μL的样本中，终浓度为0.5mM正常聚集和ATP释放花生四稀酸的最终浓度为0.5-1.0mM。

Ristocetin：瑞氏托霉素货号：396保存浓度： 125mg/mL使用浓度：1mg/ml试剂保存：未开封：2-8℃保存至效期复溶后：-20℃的分装冻存3个月试剂的准备：加入0.5ml蒸馏水所获得的最终浓度为125mg/ml，复溶试剂时不能摇晃试剂和颠倒混合试剂。

使用方法：全血标本：加8μL的试剂到1ml的样本中，终浓度为1mg/ml PRP：加4μL的试剂到500μL的样本中，终浓度为1mg/mlADP：ADP :二磷酸酰苷货号：384成分：2.5mg的二磷酸酰苷保存浓度：1mM使用浓度：10uM试剂保存：未开封0℃以下保存至效期复溶后：1、试剂需分装在-70℃，保存一年或至效期工作中保存：2-8℃保存8个小时试剂准备：加入3ml的生理盐水得到ADP试剂瓶中，充分混合后，转移至一较大玻璃容器内，再加入2ml生理盐水，充分混匀。

使用方法：全血标本：加10μL的试剂到1ml的样本中，终浓度为10uM。

正常聚集和ATP释放在全血标本中的最终浓度5-20μMPRP：加5μL的试剂到500μL的样本中，终浓度为10uM。

正常聚集和ATP释放在PRP标本中的最终浓度5-10μMThromin –凝血酶货号：386储存浓度：10U/ml使用浓度：1Unit试剂保存：未开封：0℃以下冻存至效期复溶后：-70℃保存3个月工作中保存：2-8℃24小时试剂准备：加入1毫升生理盐水所获得的浓度为10 U/ml使用方法：全血标本：加100μL试剂到1ml样本中，终浓度为1 U/mlPRP：加50μL试剂到500μL样本中，终浓度1U/ml正常ATP释放使用凝血酶的浓度为1U/mlEpinephrine ：肾上腺素货号：393储存浓度：10mM/1mM使用浓度：50μM/10μM试剂保存：未开封：2-8℃保存至效期复溶后：-70℃分装避光冻存3个月工作中保存：2-8℃8小时，避光试剂准备：加入5毫升去离子水，做全血检测使用。

用生理盐水做1：10稀释保存，做PRP检测使用使用方法：全血标本：加5μL试剂到1ml样本中，终浓度为50μM。

正常聚集和ATP释放在全血中的浓度为50μMP RP：加5μL1：10稀释的试剂到500μL样本中，终浓度1μM。

正常聚集和ATP释放在PRP中的浓度为5-10μM CHRONO—LUME Reagent 荧光试剂货号：395成份：0.2mg荧光素、22,000units 荧光素酶、硫化镁、血清白蛋白、稳定剂和缓冲液储存浓度：0.2mg荧光素加22,000units 荧光素酶/1.25ml使用浓度：2μM/L荧光素/荧光素酶/1.25ml水试剂保存：未开封：0℃以下冻存至瓶上效期复溶后：-20℃保存30天工作保存：2-8℃避光8小时试剂准备：加入1.25ml的蒸馏水，轻轻转动混合，使用前至少放置20分钟，直到试剂完全溶解使用方法：稀释式全血样本：加入100μL的试剂到900μL的稀释/全血标本中测量ATP 的释放PRP：加入50μL的试剂加入到450μL的PRP中检测ATP的释放CHRONO—LUME ATP Standard ATP标准品货号：387成分：冰冻5、-三磷酸酰苷储存浓度：2μmol使用浓度：2nmol试剂保存：未开封：0℃以下冻存至效期复溶后：-20℃冻存两周工作中保存：2-8℃24小时试剂准备：加入5ml的生理盐水得到浓度为2μmol标准中至稳定使用。

使用方法：稀释/全血：5μL试剂到1ml标本中，终浓度为2 nmolPRP：5μL试剂到500μL的PRP中，终浓度为2 nmol试剂用量如下表：编号试剂名称储存浓度最终浓度全血试剂量PRP试剂量全血聚集标本量(test)PRP聚集标本量(test)参考值(ohm)390 花生四稀酸50mM 0.5mM 10ul 5ul 1.0ml 0.5 ml 11±3 396 瑞氏托酶素125mg/ml1.0mg/ml 8ul 4ul 1.0ml 0.5 ml 12±3 384 ADP 1mM 20uM 20ul 10ul 1.0ml 0.5 ml 9±4 386 凝血酶10U/ml 1unit 100ul 50ul 1.0ml 0.5 ml -----393 肾上腺素10mM/1mM 50uM/10uM5ul 5ul 1.0ml 0.5 ml -----第三章标本的收集全血标本的要求：将静脉血与3.2%或3.8%枸橼酸钠按9：1混合（除肾上腺素外），若使用肾上腺素作为诱导剂建议标本的采集抗凝剂使用为1.5%的枸橼酸钠和2U/ml肝素，比例为9：1。