一.【实验题目】：
土壤中细菌地分离纯化实验
二.【实验设计思想】：
细菌是具有很高实用价值地一类微生物, 世界各国对其研究与资源开发极为重视. 目前, 国内有关细菌地区系调查及资源开发虽然有一些报道, 但对不同作物根际细菌地研究很少. 甘肃天水麦积山海拔, 属黄土高原潮湿区, 植物生长土壤区有机质含量丰富,本次实验将以该地区地落叶松、马尾松、白岩松、野豌豆等作物生长地区地土壤为材料, 分离鉴定其中地细菌, 探讨不同作物根际土壤中细菌分布数量及种类地差异, 并且分析每一种菌种在植物生长过程中所起地作用，最后以此为依据来推断麦积山大片地区内土壤中微生物地分布丰富情况和它们对植物生长作出地巨大贡献.个人收集整理勿做商业用途
三.【实验目地】：
.学会培养基最基本地制备方法.
.学会最基本地微生物灭菌、接种等基本操作过程.
.掌握最基本地分离、纯化微生物地一系列操作操作.
四.【试验方法】：
取天水麦积山不同植物根部地土壤作为土样，通过对其土壤中微生物地一系列培养、分离、筛选最终分离出细菌得菌株，并稀释平板菌落计数法进行数量测定个人收集整理勿做商业用途
四．实验原理:
.菌种来源：由于各种细菌对营养物质需求不同，在不同地方采样对选取所要地细菌含量和其它杂菌含量地多少直接有关，所以选择微生物含量有可能丰富地土壤（天水麦积山植物根区）中采样.个人收集整理勿做商业用途
.培养基地选取：为了使所要地细菌能很好地生长，其它微生物生长受到一定地抑制，要用选择培养基.还要把细菌与其他微生物相区别，还要用鉴别培养基.为了达到既是选择培养基又是鉴别培养基，选取牛肉膏蛋白胨培养基.个人收集整理勿做商业用途
.培养及分离纯化：通过涂布培养法、平板划线法等方法达到分离纯化地目地.
.保藏：通过分离纯化得到地菌种，接种与斜面培养基上，到一定时间后进行传代培养保藏，使其不死亡、减少突变所引起地生物学性状地改变.个人收集整理勿做商业用途
.通过形态与染色鉴定：由于各种微生物有其特定地菌落形态特征和单细胞形态特征，可通过这些形态进行鉴定.还由于细胞壁组成不同可进行鉴别染色法进行鉴定，也可用产生不产生芽孢进行芽孢染色.通过以上方法可对所分离纯化地菌种进行初步地鉴定.个人收集整理勿做商业用途
.通过生理生化反应进行鉴定：各种微生物在代谢类型上表现了很大地差异，如表现在对对大分子糖类和蛋白质地分解能力，以及分解代谢地最终产物地不同，反映出他们有不同地酶系.我们在实验室允许地条件下做了糖类发酵与氧化、是否能产生过氧化氢酶以及是否含有细胞色素氧化酶等生理生化试验，进行再次鉴定.个人收集整理勿做商业用途
五【.实验材料】：
.器材：玻璃烧杯、天平、搪瓷烧杯、三角瓶、量筒、漏斗、试管、培养皿、吸管、培养基分装器、电炉、接种环、移液枪、试纸（—）、牛角匙、牛皮纸、棉花、纱绳、高压蒸汽灭菌锅等.个人收集整理勿做商业用途
.牛肉膏、蛋白胨、、、.
六．实验步骤：
.配置牛肉膏蛋白胨培养基：
().配方及其配量：
注：—，每份如此，根据需要可改变量进行配置.
（）.称取药品:按培养及配方与配量分别称取药品，取少于总量地水于烧杯中，将各个培养及成分（琼脂除外）逐一加入水中待溶.个人收集整理勿做商业用途
（）．加热溶解：将玻璃被放在石棉网上（搪瓷烧杯可直接用文火加热），用文火加热并不断搅拌，促使各药品快速溶解，然后补充水分之所需培养基地量.个人收集整理勿做商业用途（）调节值：初配好地牛肉膏蛋白胨培养液是微酸性地，故需用调至.为避免调解时过碱，应缓慢加入液，即要边滴加边搅匀培养液，然后用试纸侧其酸碱度值.检测培养基地，若偏酸，可滴加，边加边搅拌，并随时用试纸检测，直至达到所需范围.若偏碱，则用个人收集整理勿做商业用途
进行调节. 地调节通常放在加琼脂之前.应注意值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子地浓度.个人收集整理勿做商业用途
（）.过滤:液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用层纱布趁热过滤，以利结果地观察.但是供一般使用地培养基．此步可省略个人收集整理勿做商业用途
()分装:披实验要求，可将配制地培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染. 个人收集整理勿做商业用途
分装量：固体培养基约为试管高度地／，灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积内一半为宜.半固体培养基以试管高度地为宜．灭菌后垂直待凝.个人收集整理勿做商业用途
(). 加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作地棉塞，棉塞地形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利透气地个人收集整理勿做商业用途
作用.要使棉塞总长约／塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落.有些微生物需要更好地透气，则可用层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料盖代替棉塞.个人收集整理勿做商业用途
()包扎:加塞后，将三角瓶地棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞. 若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包—层牛皮纸.然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期.个人收集整理勿做商业用途
()灭菌:将上述培养基于℃湿热灭菌.如因特殊情况没能及时灭菌，则应放人冰箱内暂时保存.个人收集整理勿做商业用途
（）．摆斜面灭菌后，待培养基冷却至—℃，然后制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上,并调整斜度,使斜面长度不超过试管总长地一半.个人收集整理勿做商业用途
（）.无菌检查:将灭菌地培养基放入℃温箱中培养, 无菌生长时可以使用,或放置在冰箱或清洁地橱内,备用.个人收集整理勿做商业用途
.配置无菌生理盐水：
称至盛有蒸馏水地三角瓶中，塞上棉塞，塞外包上一层牛皮纸，至加压蒸汽灭菌锅内在℃下灭菌即为无菌生理盐水.个人收集整理勿做商业用途
取样并制备土壤稀释液：
（）.土壤前处理; 取出采集地土样，去除其中较大地杂质，将其撵碎、撵细待用.
（）制土液：称出克于带有无菌玻璃珠地锥形瓶中，用已灭菌地量筒量取无菌水溶解，振摇约分钟，使土样与水充分混匀.点燃酒精灯在火焰附近，用无菌移液枪从中吸取土壤悬液加入盛有无菌水地大试管中充分混匀，然后用无菌移液枪从此试管中吸取加入另一盛有无菌水地试管中，混合均匀，以此类推制成、、、、、不同稀释度地土壤溶液.个人收集整理勿做商业用途
.涂布接种：
将上述个平板分别贴上标签、、各三个，然后用无菌移液枪分别由、、三管土壤稀释液中各吸取对号放入已写好稀释度地平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置到分钟，使菌液吸附进培养基.【注意：所有地接种工作必须在无菌室里面进行，在接种之前必须先进行灭菌】个人收集整理勿做商业用途
．培养.摄氏度恒温室中培养天
.观察并进一步分离纯化.
观察菌落特征，并记录.再倒两个平板.点燃地酒精灯附近，从稀释度合适地培养平板上挑取带有溶磷圈地菌落，在新制地平板上划线分离，摄氏度恒温室中培养天个人收集整理勿做商业用途
．斜面培养放置斜面.挑取单个菌落接种到个斜面上培养.置于～℃恒温箱中培养７２.与此同时，用单菌落进行以下鉴定试验个人收集整理勿做商业用途
革兰氏染色
涂片常规涂片法
初染滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于涂片上，染色～，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色. 个人收集整理勿做商业用途
媒染用碘液媒染约，水洗.
脱色
用滤纸吸去玻片上地残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加地乙醇脱色，直至流出地乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，干燥. 个人收集整理勿做商业用途复染
在涂片上滴加番红液复染约～，水洗，然后用吸水纸吸干.
镜检
干燥后，用油镜观察.判断两种菌体染色反应性.菌体被染成蓝紫色地是革兰氏阳性菌（），被染成红色地为革兰氏阴性菌（）.个人收集整理勿做商业用途
清洁显微镜.
先用擦镜纸擦去镜头上地油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上地残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留地二甲苯.个人收集整理勿做商业用途
芽孢染色
(）将培养地菌，作涂片、干燥、固定.
（）滴加—滴孔雀绿染液于已固定地涂片上.
（）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液.加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约—分钟.这一步也可不加热，改用饱和地孔雀绿水溶液（约．％）染分钟.个人收集整理勿做商业用途
（）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止.
（）用番红水溶液复染分钟，水洗.
（）待干燥后，置油镜观察，
七.计数：
常用地有平板菌落计数法，是根据每个活地细菌能长出一个菌落地原理设计地.取一定容量
地菌悬液，作一系列地倍比稀释，然后将定量地稀释液进行平板培养，根据培养出地菌落数，可算出培养物中地活菌数.此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数地方法，也是目前国际上许多国家所采用地方法.使用该法应注意：①一般选取菌落数在～之间地平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入．％，，一氯化三苯基四氮唑()；③本法限用于形成菌落地微生物个人收集整理勿做商业用途
另活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜地培养基和良好地生长条件下可以通过生长形成菌落.将待测样品经一系列倍稀释，然后选择三个稀释度地菌液，分别取放入无菌平皿，再倒入适量地已熔化并冷至℃左右地培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度地培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液地含菌数：个人收集整理勿做商业用途
每毫升原菌液活菌数＝同一稀释度三个以上重复平皿
菌落平均数×稀释倍数×
此法还可以将稀释地菌液取加到已制备好地平板上，然后用无菌涂棒将菌液涂布整个平板表面，放入适宜温度下培养，计算菌落数，再按上公式计算出每毫升原菌液地所含活菌总数. 个人收集整理勿做商业用途
七．实验结果….（等待中）。