• 细胞增殖速率、细胞存活期、细胞冻存与复苏、培 养细胞与体内生长细胞间的差异等
• 细胞生长与生存微环境的关系 • 功能细胞与支持细胞的相互关系 • 功能细胞与其支持物——ECM的关系 • 功能细胞的生长繁殖与三维空间的关系 • 功能细胞的生长繁殖与应力等物理因素的关系
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• 组织工程是近年来正在兴起的一门多学科交叉的边缘学科， 属于生物高技术范畴，它融合了细胞生物学、工程科学、 材料科学和外科学等多个学科，必将促进和带动相关高技 术领域的交叉、渗透和发展，并由此衍生出新的高技术产 业。
• 组织工程的概念一提出，就受到各国学者的广泛关注，目 前，美国已有相当数量的研究机构（包括NASA、DOE、 NIH等），许多相关大学（包括MIT、HMS、GIT、UCSD、 UMASTFFU）都参与了组织工程的研究。我国也掀起了一 股组织工程热，目前已在软骨、骨、肌腱、血管、皮肤、 角膜等领域取得了可喜的进展。
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• 基质细胞包括其他的疏松结缔组织细胞，在细 胞复合培养中充当“饲养”细胞的作用。基质 提供复合培养的支架，种植并生长于其中的基 质细胞分泌生长因子，以保证种子细胞增殖并 使细胞培养长期维持。
织类型广泛，理论上讲它能分化为所有的间充质组
织类型，如：软骨、脂肪、肌肉及肌腱等。
• 目前用于分离MSC的方法主要有：密度法三种。
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3.1.3 内皮细胞：
• 内皮细胞应用于组织工程构建，在技术上经历了三 个发展阶段：静脉内皮细胞单期种植；微血管内皮 细胞单期种植；自体内皮细胞扩增培养种植。 Munerett等对动脉和毛细血管系统来源的内皮 细胞进行了研究，发现主动脉内皮细胞所形成的毛 细血管结构比其他两种细胞形成的结构更稳定持久， 更适合成为组织工程种子细胞来源，但是主动脉组 织在临床难以获取，最终应用存在一定问题。
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图c. 人表皮干细胞培 养10d时基本融合 (×400)
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图1 原代培养的人羊膜间充质 细胞形态特征(×100)
图2 原代人羊膜间充质细胞表达波形蛋 白（免疫细胞化学染色，×400）
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3.2 种子细胞的体外培养
种子细胞体外培养时存在多问题，需要考虑各 种影响因素。
3.2.1 培养细胞的生存期
• 培养细胞的生存期指细胞在连续传代情况下生存的 时间，一般用能传多少代表示。正常细胞都有有限 的生存期。如培养的肌腱细胞生存期为13代，软骨 细胞为6代，成纤维细胞能传50代。细胞到生存期 的末代，表现出细胞生长缓慢或不增殖甚至死亡。
• 因此，若要保存某细胞，则要在该细胞传代培养的 旺盛时期进行冻存。目前世界上常用细胞均在10代 内冻存。
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1.2组织工程学的发展
• 组织工程学的建立和发展与很多因素有关： ①随着人类物质、文化生活水平的提高，对损伤、疾病的治疗
要求越来越高，不仅要求治好伤、病，还要求良好的功能及 完美的外形，需要寻找新的治疗途径。 ②科学技术总体水平的提高，如完善的细胞培养技术和可控降 解的高分子材料的问世，为体外构建“组织”、“器官”提 供了条件 ③高、新技术的开发与利用是组织工程学研究的基础，如基因 工程技术、免疫隔离技术等为改造细胞提供了新方法。 ④巨大的市场需求为组织工程学发展注入了动力。众多的投资 公司注入大量资本进行组织工程学研究。这些是组织工程学 研究发展的基础与动力。
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3.1 种子细胞来源
3.1.1 胚胎干细胞（ESC）:
• 存在于哺乳动物发育早期胚胎中的（着床前）多能 干细胞，具有持续增殖而不分化的能力以及经诱导 后可分化形成一个成熟个体中所有类型细胞的潜能。
• 细胞定向分化的尝试在动物中已取得了可喜结果， 神经元细胞、造血细胞以及心肌细胞已在体外获得。
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3.2.3 体外培养细胞与体内细胞存在差异
• 由于体外模仿的技术尚不十分完善，因此目前 培养细胞与体内细胞仍然存在着差异。
• 按照组织工程的需要，可将差异分为两类：功 能差异和生长、增殖差异。
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功能差异
• 细胞体外培养的功能差异指在体外培养条件下， 细胞降低甚至丧失了其在体内的合成、分泌等功 能，即细胞的分化特性减弱或不显著。
• 细胞的三维培养是指细胞在模拟体内细胞的化 学、物理和生物学条件下，在三维基质支架中 进行培养。
• 考虑到体内细胞生长的多因素影响及多细胞相 互作用，细胞的复合培养除种子细胞与支架材 料的复合外，还包括多种细胞的复合，如种子 细胞与基质细胞复合培养
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• 组织工程细胞技术可分为三类：①分别提取、分 别培养、分层种植。如对内皮细胞和间质细胞分 别提取，各自培养，种植时先种间质细胞再种内 皮细胞。②混合提取、分别培养、分层种植。一 起提取内皮细胞和间质细胞，体外将细胞分离， 分别培养扩增，分层种植。③混合提取、联合培 养、混合种植。两种细胞一并提取，不分离，联 合培养，并一齐无序地种植到支架表面。至于哪 种方法较好，目前尚无定论。
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3 种子细胞研究
• 种子细胞的培养是组织工程的基本要素，细胞主要 来源于自体、同种异体、异种组织细胞等。自体组 织细胞应为首选。
• 现在的研究多集中于以下的几个方面： • 载体等技术用于细胞的快速增殖 • 干细胞工程 • 采用各种生长因子和端粒酶调节与延缓细胞的 老化 • 采用各种方法（包括自身转化、化学、物理、 病毒等）诱导细胞发生转化，使其倍增时间减 少，永生化或生命期延长.
组织工程
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目录
• 组织工程学及其发展 • 组织工程研究内容 • 组织工程种子细胞研究 • 组织工程支架材料 • 组织器官的构建 • 组织工程面临的挑战
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1.组织工程学及其发展
1.1 组织工程学概念
• “组织工程学”概念是1987年Robert Langer和Joseph P Vacanti在由美国科学基金会举办的生物工程小组会上首次提 出的，1988年正式定义。
• 要细胞保持其功能就必须尽可能地模仿体内环境，在 保持细胞功能的基础下，为了适应组织工程的需要， 还需不断摸索新的培养方法，使细胞增殖更快，并且 在应力等物理条件下三维生长，以达到构建活材料的 目的。
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3.3 细胞与材料复合的三维培养
• 细胞在体内所处的化学和物理环境非常复杂， 完全不同于体外普通的单层细胞培养。
• 细胞的增殖和分化是细胞生命进程中所获得的基本属 性。增殖使细胞数量增多，分化使机体结构和功能多 样化，表现在细胞与细胞之间呈现高度的相互依存性 和个体细胞相对失去独立性。
• 细胞由体内移至体外培养，在适宜的条件下，其增殖 能力得以提高，同时由于人为控制条件，细胞的分化 功能得以保留，这是组织工程构建活材料的基础。
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组织工程研究内容
• 组织工程的核心 • 建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具 有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形 态、结构和功能的重建并达到永久性替代
• 基本原理和方法 • 将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种 生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上 形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机 体组织、器官的病损部位，随着生物材料逐渐 被机体降解吸收，细胞生长、繁殖、分化形成 在形态和功能上与相应器官、组织一致的新的 组织，达到修复创伤和重建功能的目的。
• 体内绝大多数功能细胞是高分化细胞，或称特化 细胞，某一功能高度发达而其他分化潜能相对丧 失的细胞，通常代谢相对缓慢，不增殖或增殖十 分缓慢，如肌腱细胞。在体外培养条件下，这些 不增殖或增殖缓慢的细胞都可以在培养基中成倍 的增长甚至传代，这无疑给组织工程大量繁殖细 胞带来了方便。
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• 众多细胞培养实践表明，细胞生物学及形态的改变 程度取决于细胞生存环境因素改变的大小，即体外 培养环境接近体内的程度。培养条件越接近，则细 胞的生物学行为越接近体内细胞。因此，目前在组 织工程研究过程中必须进一步弄清体内细胞间的相 互关系。
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体内外细胞增殖分化差异与组织工程的关系
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2.组织工程研究内容
• 组织工程研究包括以下四个方面 • 种子细胞研究 • 细胞外基质的研究 • 组织器官的构建 • 组织工程临床应用
• 此外，还须同时进行一下研究 • 检测方法及检验标准。 • 临床验证方法及策略研究。 • F产业化研究。
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3.1.4 成纤维细胞：来源广泛数量相对较多，便于
体外培养与扩增。
3.1.5 各种成体干细胞
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图a.贴壁筛选的人表皮干细胞 接种后呈圆形，细胞体积较小， 折光性较强（×400）；
b
图b.人表皮干细胞培养
3d时呈明显克隆性生长
(×400)；
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塑料培养板表面的细胞，它具有向骨、软骨、脂肪、
肌肉及肌腱等组织分化的潜能。
• 在机体内MSC存在于许多组织中，尤以骨髓中最
多.