The effects of protein content to starch’s enzymolysischaracterZhongDong Liu Henan University of Technology ZhengZhou, Chinaliuzhongdong@LiZheng BiHenan University of Technology ZhengZhou, Chinabilizheng123@Guojin YanHenan University of Technology ZhengZhou, Chinayanguojin@Shijie YangHenan University of Technology ZhengZhou, Chinalzd@Chao YangHenan University of Technology ZhengZhou, Chinadrlzd@Liu Boxiang Illinois Wesleyan UniversityIL, USAjollier.liu@Abstract：The research studied the best condition for protein purification in the wheat starch , for preparation of the wheat starch and the influence of the starch grain protein in the structure and properties when the starch is hydrolyzed . Firstly, we ensured the optimum condition for the Wheat protein purification by orthogonal test, at the same time , we obtained different protein content of wheat starch ,the next step is to measure the protein content by the Kjedahl determination. Contrast between the SDS and protease in nitrogen function before setting-out the Enzymatic hydrolysis degree and the crystallinity in the starch samples of different nitrogen.It can be concluded from those experiments that compared with the SDS, the Protease is more effectively to remove the starch grain protein, which is useful to hydrolyze starch particles.Keywords：The wheat starch ; Protein purification; The Enzymatic hydrolysis degree淀粉中蛋白含量对淀粉酶解性质的影响刘钟栋1，毕礼政 1 ,阎国进1,杨士杰1，杨超1，Liu Boxiang21.河南工业大学，郑州，中国，4500522. Illinois Wesleyan University ,1312 Park Street Bloomington, IL, USA【摘要】本文主要对小麦粉洗淀粉过程中影响淀粉蛋白含量的因素及淀粉颗粒蛋白对淀粉酶解性质的影响进行了研究。
首先对洗淀粉过程中影响其蛋白含量的条件进行了单因素试验，再用SDS溶液和蛋白酶除去其中的蛋白质成分，得到不同蛋白含量的小麦淀粉，以凯氏定氮法测定其中蛋白质含量。
然后对除去蛋白的小麦淀粉样品进行定氮，对比两种除蛋白方法之间的优劣，然后以不同蛋白质含量的淀粉样品同时做酶解度测定试验，讨论蛋白质对淀粉在酶解过程中性质和结构的影响。
试验表明，蛋白酶比较有效地除去淀粉颗粒蛋白，而颗粒蛋白确实有助于淀粉的水解。
【关键词】小麦淀粉；蛋白纯化；酶解1 引言淀粉中含有少量的蛋白质，但是这少量的蛋白质在淀粉的水解和参与其他化学反应中起到重大作用，然而关于这方面的研究却至今没有准确的答案，从整个研究淀粉及2010 First International Conference on Cellular, Molecular Biology, Biophysics and Bioengineering (CMBB)978-1-4244-9158-2/10/$26.00 ©2010 IEEE CMBB2010其中的蛋白质的历史来看，酶解和酸解及其它一些物理化学方法对分析淀粉结构及蛋白质对其的影响是相当有用的手段。
现代化仪器和分析方法的发展对揭示淀粉的内部结构起到很大的作用，特别是显微技术和近代的液相色谱分析技术的发展对展示淀粉的结构信息有突出贡献。
透射电子显微镜和扫描电子显微镜，尤其高分辨率原子力显微镜(AFM)的发展，已能够直接观测淀粉颗粒的形貌，进而成为证实有关蛋白质影响淀粉颗粒结构的推测是否成立的重要手段。
2 材料与方法2.1 实验材料与仪器2.1.1 实验材料小麦面粉课题组试验田中的小麦自制复合蛋白酶诺维信生物技术有限公司淀粉液化酶诺维信生物技术有限公司2.1.2 实验试剂十二烷基硫酸钠化学纯天津3,5-二硝基水杨酸分析纯洛阳碘化钾分析纯宿州碘化汞分析纯开封2.1.3 实验主要仪器紫外可见分光光度计 TU-1800PC 北京消化炉 FE20型上海台式低速离心机 TDL-5-A型上海磁力搅拌器 HT-3型深圳 HT-4型深圳电子天平 AY120 日本电热鼓风干燥箱 101C-2B型上海2.2 试验方法2.2.1小麦淀粉制备本实验基于实验室的条件采用马丁法水洗和离心相结合的工艺制备小麦淀粉。
工艺流程：小麦面粉→和面熟化→洗面→过筛沉降→离心分离→干燥→粉碎操作要点：1 和面将面粉(面粉样品取50g)和水以一定比例拌和成均匀柔软光滑的面团, 水温20℃ , 然后将其置于烘箱中（烘箱中要同时放入少量的水，以防止湿度过低而影响面筋的形成），恒温静置, 开始洗面。
2 洗面、过筛与沉降向盛面团的大烧杯中加入适量洗涤盐水并不断揉搓, 得面浆和中间面团, 再将面浆通过80目标准筛, 得淀粉乳和少量面块, 将中间面团和少量面块收集, 重新加人适量清水再次洗面、过筛, 如此反复几次, 最后将所有淀粉溶液收集，并静置沉降。
3 离心分离将沉降后形成的淀粉乳转入离心管, 在3000转/min 下离心10min, 得到湿淀粉块。
采取分开收集的原则：上层混有面筋的淀粉，和下层的较为纯净的淀粉各自单独收集。
将离心管上层物质重复上述操作。
操作过程中应按先大后小的原则选取离心管，离心效果较好。
4 干燥放在鼓风干燥箱内50℃烘干。
5 粉碎与过筛干燥后的淀粉块用实验磨磨碎，过80目筛既得小麦淀粉。
本课题选用与面筋密切相关的四个因素：和面用水量、静置温度、静置时间、洗涤盐水浓度，进行了单因素实验。
2.2.2 凯氏定氮测定蛋白质按照文献[1]进行测定蛋白质含量。
2.2.3 除蛋白1：称取30克淀粉样品，溶于80ml水中。
磁力搅拌2min后3000转/min离心10min。
倒出上清液。
加入40ml2%的SDS溶液将沉淀溶解，磁力搅拌2h后，以3000r/min离心10min，倒出上清液。
将沉淀用水溶解，磁力搅拌2min后，以3000r/min离心10min，倒出上清液，如此水洗5次，得到沉淀，烘干，再用凯氏定氮法测定其蛋白含量。
2：取1中的淀粉样品3g，加入2g复合蛋白酶及40ml水，50℃下，震荡酶解数小时后，3000转/min离心10min,去上清液，再加水，磁力搅拌2min后离心，如此清洗离心2次，彻底洗去可溶的蛋白酶、多肽及氨基酸，得到淀粉沉淀，烘干，按2.2.2测定其蛋白含量。
2.2.4 淀粉样品酶解性测定准确称取5份含氮量不同的淀粉样品各1g，加入100ml的容量瓶中，定容，然后放进50℃水浴中预热15min。
用移液管准确移取0.4ml淀粉液化酶于100ml的容量瓶中，定容，放入50℃水浴中预热15min。
50℃下，取1ml 酶液与1ml 淀粉液于一试管中，反应2min ，加入1mol/L 的 NaOH 溶液2ml 终止反应，摇匀。
取2ml 反应液与2mlDNS 试剂于沸水浴中反应5min ，静置冷却，用紫外分光光度计于660nm 处测定其吸光度，根据淀粉完全水解的吸光度，分别测定5份淀粉样品的酶解度。
3 实验结果与讨论3.1小麦淀粉分离单因素实验结果3.1.1和面用水量小麦淀粉的制备中，减少蛋白杂质的关键就是使蛋白质彻底形成面筋,因此要想得到蛋白含量低的淀粉, 首先要形成面筋。
面筋的形成过程是面粉中的蛋白质凝胶有限溶胀的过程, 在和面的过程中, 蛋白质与水充分均匀接触, 发生水化作用, 形成面筋。
蛋白质和水分子的相互作用主要是通过氢键和疏水作用的方式而实现的, 而水分子的多少直接影响着氢键的数量及疏水作用力，因此，水在面筋的形成过程中起着重要的作用, 由图1知，当水量在25-40ml 时，淀粉蛋白含量最低时的用水量为30ml 。
Figure 1. The effects of water quantity to the protein residuces.图1 和面用水量对蛋白残留量的影响3.1.2静置温度面筋的形成量与面筋蛋白的活性直接相关，而蛋白活性对温度的变化非常敏感，适当的温度能极大地提高面筋的形成速度及形成量，而温度过高或温度过低都会降低面筋蛋白的活性，从而影响面筋的形成。
由图2可知，当静置温度为35℃时，蛋白残留最少。
Figure 2. The effects of standing temperature to the protein residuces.图2 静置温度对蛋白残留量的影响3.1.3 静置时间静置的目的是为了使蛋白质充分吸水、膨胀, 形成紧密的网状结构,而不致在冲洗过程中把面筋洗如淀粉中, 影响淀粉的纯度。
麦胶蛋白和麦谷蛋白吸水形成面筋网络组织需一定时间,由图3可知，静置时间小于25min 时, 随着静置时间的延长, 蛋白残留在减少, 大于25min 时，蛋白残留却出现上升。
这是因为静置时间过长面筋胶团中吸收的水分又溢出, 出现黏性, 面筋网络被破坏,容易在洗的过程中流失,而进入淀粉中。