茯苓多糖的提取及其抑菌研究胡朝暾, 肖 毅, 周鹏飞, 付 明, 胡 兴(怀化学院11生命科学系; 21民族药用植物研究与利用湖南省重点实验室,湖南怀化 418008)摘 要:对茯苓多糖的提取方法和抑菌试验进行了初步的探索1设计了两种不同提取茯苓多糖的方法,分别为:稀碱浸提法和水提醇沉法1通过比较上述两种不同方法的多糖提取率,发现稀碱浸提法的提取率较高,是一种较好的茯苓多糖的提取方法1另外采用纸片扩散法(K-B 法)对两种方法所提茯苓多糖进行抑菌试验,实验结果表明:茯苓多糖对革兰氏阳性菌和阴性菌都有一定的抑制效果,特别对大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌效果明显1关键词:茯苓; 茯苓多糖; 多糖提取; 抑菌试验中图分类号:Q949195 文献标识码:A 文章编号:1671-9743(2012)08-0015-04收稿日期:2012-07-28基金项目:湖南教育厅一般项目(09C756);怀化学院青年基金项目(HHUQ2009-12);民族药用植物研究与利用湖南省重点实验室委托项目(HHUW2011-53)1作者简介:胡朝暾(1977-),男,湖南安化人,怀化学院讲师,博士生,主要研究蜘蛛生理学、生态学和蜘蛛毒素1茯苓(poria cocos (Schw 1)Wolf)为多孔菌科卧孔菌属真菌茯苓的干燥菌核,多依附松树根生长1茯苓主要分布在我国的云南、贵州、湖北和湖南等地[1]1是我国传统的中药材和历史悠久的食品,也是湖南靖州重要的生物资源1在中国传统医学中,茯苓的药用已有二千多年的历史了15神农本草经6中,把茯苓列为上品,有/久服安魂养神,不饥延年0的作用1此外,茯苓也是我国一种历史悠久的食品1早在唐朝集市食摊上就有用茯苓、糯米、白术磨粉制成的茯苓糕,后来先后又出现了茯苓包子、茯苓粥1因此,茯苓也是国家卫生部、国家中药管理局颁布的/既是食品又是药品的品种名单0的一种1药理实验表明茯苓具有渗湿利尿、合胃健脾、宁心安神、抑菌、增强机体抗病能力及降低血糖的功效[2-5]1其中主要功能体现者为茯苓多糖1茯苓多糖(pachy man)是近年来研究较多的一种真菌多糖,约占整个茯苓菌核干重的70%-90%[6]1茯苓多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、增强机体免疫力、保肝、催眠、抗炎等作用[7],可广泛应用于医疗保健、食品等领域1茯苓多糖可用于抗肿瘤药物的研发,从而为肿瘤、癌症的治疗提供新的方法,还可作为免疫增强剂,用于保健品的开发与研制1因此,茯苓多糖的提取及开发意义重大1故对茯苓多糖的提取进行探索,并对其抑菌效果进行初步的检测12 材料与方法211 材料茯苓:购自湖南怀化市靖县茯苓大市场1带回实验室后切成小块后用粉碎机粉成粉末,放入30e 的烘箱中干燥后备用1枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌来自怀化学院生命科学系微生物学实验室1212 试剂与溶液的配置21211 基本培养基:牛肉膏3克,蛋白胨10克,NaCl 5克,琼脂5克,水1000ml 、pH 710~712、121e 灭菌20min 121212 5%苯酚试剂的配制:称取苯酚5g,加水100ml 使溶解,至棕色瓶中,得浓度为5%苯酚试液121213 标准葡萄糖溶液的配制:精密称取105e 干燥恒重的葡萄糖50mg,加水溶解并定容至1000ml 容量瓶中121214 茯苓多糖溶液的配制:精密称取茯苓多糖50mg,加水溶解并定容至500ml 容量瓶中,过滤,滤液备用121215 015麦氏比浊管的配制01048mol P L 的Bacl 2015ml 和0118mol P L 的H 2SO 4第31卷第8期怀化学院学报 Vol 1311No 182012年8月JOURN AL OF HUAIHUA U NIVERSITYAug 1,20129915ml充分混匀121216其他的试剂:乙醇,丙酮、乙醚、氢氧化钠、稀醋酸、二甲基亚砜、鞣酸、活性炭等试剂为国产分析纯1213实验仪器德国进口SI GMA3-18K高速冷冻离心机;美国进口的D U-800紫外可见分光光度计;上海大普仪器有限公司P HS-3C高精度酸度计;余姚市东方电工仪器厂202-3A电热恒温干燥机;上海之信仪器有限公司JY99-IID超声波细胞粉碎机;佛山顺德格兰仕微波炉电器有限公司WP800TL微波炉214茯苓多糖的提取方法21411稀碱浸提法准确称取茯苓粉末10g溶于4e0115mol P L NaO H 2000ml液中,搅拌至粉末溶解,此时溶液呈粘稠状态;4e以下冷藏,过夜,抽渣弃去,滤液以10%的醋酸液中和至pH610,再加入等体积95%乙醇,于4e 放置过夜;8000r P min离心取沉淀,流水透析两天1再依次用蒸馏水、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后,减压抽干,冷冻干燥,即得茯苓多糖粗品,呈淡黄色细颗状结晶1准确称取茯苓多糖粗品5g,溶于500ml二甲基亚砜中,在室温下用磁力搅拌器搅拌15h后,加入500 ml蒸馏水,继续搅拌20min,放置2h,8000r P min离心得沉淀1沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,冷冻干燥,即可得茯苓多糖纯品121412水提醇沉法准确称取茯苓2g,切成碎片,加入200ml的水,重复提取3次,每隔2h提取一次1合并3次提取液过滤,除去不溶性杂质,得滤液1取上述所得滤液,减压蒸馏浓缩,在搅拌下加入乙醇,使含醇量达到80%,静置12h,8000r P min离心得沉淀,收集沉淀1溶解煮沸加蒸馏水60ml,趁热滤除不溶物,滤液在搅拌下再加入乙醇,使含醇量达到80%,放置,析出褐色沉淀后,冷冻干燥,即得茯苓多糖粗品1将粗品溶于150ml蒸馏水中,煮沸,在搅拌下加入1%鞣酸溶液,煮沸,8000r P min离心1取上清液加入鞣酸溶液不混浊为止1加入2%的活性炭,搅拌10 min,趁热用布氏漏斗滤过,滤液放冷,加入乙醇使含醇量达到70%,静置24h,滤取析出物1用70%乙醇100ml,反复洗涤沉淀,检查不含鞣酸为止(也就是当上清液中不出现混浊为止)1将湿品溶于一定量的20%热乙醇中,置于布氏漏斗中过滤,减压后,再加入60e热蒸馏水连续洗脱,流出液减压浓缩,加入乙醇使含醇量达到70%,放置,滤取沉淀冷冻干燥,即得茯苓多糖纯品1215多糖含量的测定茯苓多糖的测定主要采用Dubois等提出的苯酚-硫酸比色法[8]1该方法的原理为[9]:糖在浓硫酸作用下,水解生成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,然后与苯酚缩合成橙黄色化合物,且颜色稳定,在波长490nm处和一定的浓度范围内,其吸光度与多糖含量呈线性关系正比,从而可以利用分光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量,本方法可用于多糖、单糖含量的测定1216茯苓多糖抑菌实验抑菌试验采用K)B纸片扩散法进行,具体过程如下:先用普通培养基对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌进行活化1活化好之后,将枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌,以浓度约为5@107 cfu P ml的菌量分别接种到普通营养培养基表面1将两种方法所提茯苓多糖配置为1mg P ml的溶液,以无菌操作将在两种茯苓多糖溶液中和无菌水中浸泡1h的直径为014c m的滤纸片分别贴到培养基上,37e培养24h1每个试验做3个平板重复1最后观察抑菌效果13结果与分析311茯苓中多糖的含量31111标准曲线的制作按照标准曲线的制作方法配制溶液,充分混匀,静置20min于490nm处比色,记录A490值,记录在表1中1表1标准葡萄糖溶液的A490值管号123456789 A49000104601109011370119701242012890134201405用标准葡萄糖含量(mg)为横坐标,用吸光度值A490为纵坐标,用标准曲线计算程序软件作图,即得到一条标准曲线,见图11#16#怀化学院学报2012年8月图1葡萄糖标准曲线图31112水提醇沉法的多糖含量取1、2、3三支试管分别加入2ml的已定容100ml 的茯苓多糖提取液,再加入2ml苯酚、6ml浓硫酸充分混匀,静置20min于490nm处比色,记录A490值,记录在表2中1表2水提醇沉法的多糖溶液的A490值管号123A490012820125801261由表2可知水提醇沉法的多糖的A490的平均值为012671则把01267代入上述方程得样品浓度为010434 mg1由公式样品含量w=(C@V总@D)P(W@V测@ 106)@100%1其中:C)))在标准曲线上查出的糖含量(毫克); V总)))提取液总体积(毫升)V测)))测定时取用体积(毫升);D)))稀释倍数;W)))样品重量可知w=(010434@103@200@100)P(2@2@106) @100%=2117%1所以水提醇沉法提的多糖的含量为:2117%1 31113稀碱浸提法的多糖含量称茯苓10g用稀碱浸提法所得茯苓粗多糖为7160 g1称5g茯苓粗多糖精制后得茯苓纯多糖4178g1由上可知稀碱浸提法的多糖含量为:w%=716P10 @4178P5@100%=721656%综上可知,两种方法即稀碱浸提法和水提醇沉法所提多糖的含量以稀碱浸提法的得率较高为721656%1 312茯苓多糖的抑菌实验为了探讨茯苓多糖的抑菌效果,使用枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢图2茯苓多糖对大肠杆菌(Escherichia coli)抑菌圈图A:碱性多糖B:水性多糖C:无菌水图3茯苓多糖对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)抑菌圈图A:水性多糖B:碱性多糖C:无菌水#17#第31卷第8期胡朝暾,等:茯苓多糖的提取及其抑菌研究杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌进行试验1将细菌接种于平板培养基上,于37e 培养24h 后从培养箱中取出,观测抑菌效果,并拍照1结果发现茯苓多糖对大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌抑制较效果较明显1结果如下:以上结果表明:碱溶性多糖和水溶性多糖对大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌都有一定的抑菌作用,但是碱溶性多糖的抑菌效果比水溶性多糖抑菌效果要好1苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌,大肠杆菌为革兰氏阴性菌1因此茯苓多糖对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有一定的抑菌效果14 讨论作者通过查阅文献资料,搜索到在真菌多糖的提取过程中常应用的两种不同的提取方法,通过相关提取实验后进行含量测定1多糖含量的测定是利用当前普遍应用的苯酚-硫酸法,但是标准曲线有轻微的非线性,而且随着时间的延长,非线性越明显,所以多糖测定时间控制在10min-30min 内最好1通过多糖含量测定可知两种提取方法所提取的多糖总量有比较明显的差别1稀碱浸提法所提多糖含量高于水提醇沉法1并且水提醇沉法含有水溶性的杂蛋白等物质1用浓碱浸提,虽然收率比水提醇沉法高,但因其溶液稠度较大,难以过滤,操作周期较长1二甲基亚砜可使蛋白质裂解为小分子的易溶于水的肽类物质,因此可用它来除去杂蛋白1综上所述,采用稀碱提取方法,用二甲基亚砜进行精制法较为合理,操作周期短,工艺简单易行1在做细菌的抑菌试验中发现茯苓多糖无论是对革兰氏阳性还是阴性都有较好的抑菌效果,然而在临床上用的抑菌药抗生素对自身都有很大的副作用,茯苓多糖的抑菌作用的发现可能对临床上抑菌用药方面起到一定的指导作用1并且在对大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌抑菌性实验中,发现碱溶性多糖的抑菌效果比水溶性多糖好,原因可能是碱溶性多糖的结构与水溶性多糖的结构不同所导致的1参考文献:[1]中国药科大学.中药辞海[M].北京:中国医药科技出版社,1996:1272-1278.[2]沈映君.中药药理学[M ].上海:上海科学技术出版社,1995:87-89.[3]徐锦堂.中国药用真菌学[M ].北京:北京医科大学P中国协和医科大学联合出版社,1997:547-573.[4]应建浙,卯晓岚,马启明,等.中国药用真菌图鉴[M].北京:科学出版社,1987:202-203.[5]杨冉,李建军,屈凌波,等.茯苓萜类的高效液相色谱指纹图谱研究[J].中草药,2004,35(3):273-275.[6]张敏,高晓红,孙晓萌,等.茯苓的药理作用及研究进展[J].北华大学学报(自然科学版),2008,9(1):63-68.[7]刘林,霍志斐,史树堂,等.茯苓多糖的药理作用概述[J].河北中医,2010,32(9):1427-1428.[8]Dubois M,Gil les KA,Hamilton JK,et al.A colorimetricmethod for the determination of sugars [J].Nature,1951,168(4265):167.[9]Saha SK,Brewer EF.Determination of the concentrations ofoligosaccharides,complex type carbohydrates and glycoproteins using the phenol -sulfuric acid method [J ].Carbohydr.Res.,1994,254B 157-167.The Studies of Pachymaran Extraction and Antibacterial TestHU Zhao-tun, XIAO Yi, Z HOU Peng-fei, FU Ming, HU Xing(11Department o f Li fe Science ; 21Key Laboratory of Research an d Utilization o f Ethnome dicina l Plant Resources of H unan Province ,Huaihua University ,H uaihua,Hunan 418008)Abstract :In this research,Preliminary e xploration of the Pac hymaran extraction method and antibacterial test had been done.It had designed two diffe rent e xtrac tion me thods of Polysaccharides,which were dilute alkali extrac tion,Water e xtraction and alc ohol precipita t ion.By comparing the two different methods of e xtrac tion rate of polysaccharides,it is found that the e xtrac tion rate of the dilute alkali extraction method is the higher,which is a better method of e xtrac ting Pachymaran.In addion the extraction Pachymaran antibacterial experiments we re designed by using the disk diffusion method (KB method).Experimental results sho w that Pachymaran has some effect on Gra m-posit ive and Gra m-ne gative bac teria,especially effec ts of E.coli and Bacillus thuringiensis.Key words :poria cocos ; pachymaran; polysaccharide extraction; antibacte rial test#18#怀化学院学报 2012年8月。