Gateway™技术提供以下可能：∙通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间∙将您的基因转入到多个表达系统∙在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。

这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。

当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。

Gateway™也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。

Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。

一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway™改造过的的各种表达载体（目的载体）。

此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。

在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。

图1-Gateway™技术的灵活性*目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。

一种强大而可靠的技术Gateway™技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。

一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。

Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。

BP和LR两个反应就构成了Gateway™技术（表1和图2）。

BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。

LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。

LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。

Gateway™技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。

典型的效率是＞95％。

需要了解更多的有关ccdB的信息，请参考术语表。

表1-反应和术语总结完成构建Gateway™表达克隆仅需两步（图2）：1.创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。

2.混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway™ LR Clonase™酶，产生表达克隆。

（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。

）图2-Gateway™技术总结在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。

可以通过以下几种方法构建Gateway™入门载体。

无论您选择何种方法，创建的入门载体都是用来与各种目的载体进行重组。

图3-Gateway™定向TOPO®克隆PCR克隆（定向TOPO®克隆至入门载体或与供载体BxP重组）∙限制性内切酶消化和连接进入入门载体∙使用pCMV·SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway™兼容cDNA文库∙Gateway™改造过的克隆资源*( * 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。

这些克隆可以通过与供载体及BP Clonase™酶反应转换到入门载体。

请登录/获得已有克隆资源的更多信息。

)PCR-定向(PCR-Directional)TOPO®克隆定向TOPO®克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。

进行5分钟的简单连接，产生＞90％的重组子。

您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。

定向TOPO®克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。

平端PCR产物定向克隆的效率＞90％，从而简化了筛选。

同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或限制性内切酶。

目前有两种定向TOPO®克隆载体:pENTR/D-TOPO® 和pENTR/SD/D-TOPO®（表2和图3），它们具有有以下特点：∙位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway™目的载体进行有效重组∙通用M13位点便于测序∙基于pUC的ori位点提供高产量质粒∙大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选表2-两种pENTR/D-TOPO®载体的简单比较构建入门载体的各种选择A 限制性内切酶消化作为PCR克隆的替代方法，有5种Gateway™入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。

这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。

为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5个Gateway™入门载体提供了Kozak 序列。

此外，pENTR™11提供了SD (Shine-Dalgarno)序列，便于在大肠杆菌中有效的翻译。

B PCR重组克隆重组是从PCR产物创建Gateway™入门克隆的另一种方法。

这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育扩增PCR产物和pDONRTM载体(包含attP位点)及Gateway™ BP ClonaseTM酶混合物。

接着转化进大肠杆菌中，您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。

这个入门克隆可以与任何Gateway™目的载体进行重组（参看图2）。

C Gateway™改造过的cDNA文库如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONRTM载体和BP ClonaseTM酶混合物进行一个简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway™入门克隆。

这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间。

SuperScript cDNA 文库使用pCMV·SPORT（登录获得更多信息）构建，有几种的人组织来源可供选择，这些文库有很大一部分是全长的插入片段，可以完全代表来源mRNA。

如要了解Gateway兼容文库的详细列表，请登录/fulllength.D 入门克隆的切入点――克隆资源您可以从与10000个与人类基因相关的35000个克隆中进行选择，这些克隆的70％以上是全长序列的。

这些克隆来源于使用特殊的高级cDNA文库构建技术，oligo dT引物，以及SuperScriptTM II 反转录酶所构建的文库。

许多克隆来源于I.M.A.G.E.协会，NCI CGAP 项目，ResGenTM库或UltimateORF库。

克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体，所以可以快速地将基因转到各种表达系统中。

图4-进入G ateway™系统的各种路线* 目前的克隆资源带有attB位点，需要与pDONR质粒重组触手可及的最高级表达系统一旦您构建好Gateway™入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。

使用Gateway™技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统。

因为没有一个单一的表达系统蛋白适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白（图5）。

为了扩展表达的选择，Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中。

无论您选择哪个系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――都可以获得Gateway™目的载体。

此外，你可以很容易地把你自己最喜欢的表达载体转换成Gateway™目的载体。

图5-在Gateway™系统表达全长开放阅读框大肠杆菌GUS基因、人类MAP4和Eif-4E基因平行转移进目的载体，在Sf9昆虫细胞(杆状病毒)或大肠杆菌BL21-SITM菌株表达天然蛋白、N-端His或N-端GST融合蛋白。

在所有的系统中均观察到GUS良好的表达，而MAP4只在昆虫细胞中表达，Eif-4E只在大肠杆菌中表达。

在Hartley, J.L. et al. (2000) Genome Research10(11):1788-95 可以找到更多的细节。

表3-Gateway™技术入门选择体外表达Expressway in vitro蛋白合成系统简化当前市场上的体外（无细胞）表达系统。

仅需两小时，您就可以在一个反应管中获得高达50μg 的表达蛋白，而无须传统细胞表达体系的烦琐和花费。

仅需加入优化构建的超螺旋或线性DNA模板到Expressway反应管，DNA模板由T7启动子驱动。

每一个反应管中包括大肠杆菌（E.coli）抽提物（可以同时进行转录和翻译）和强大的ATP能量更新系统（保证连续高水平活跃蛋白表达的能量水平要求）。

Gate way™技术为进行基因功能分析和蛋白表达提供了广泛深入的方法。

您可以通过把目的基因转移到优化构建的体外表达载体，pEXP1-DEST 或pEXP2-DEST（表4）（包括在系统中），然后开始体外蛋白合成。

pEXP1-DEST 或pEXP2-DEST载体中的T7启动子，核糖体结合位点（RBS）(仅pEXP1-DEST)以及T7终止子之间的间隔的序列搭配都为Expressway的蛋白表达专门优化（图6），从而用Expressway进行蛋白表达。

转移的基因定向、阅读框正确，并随时可以用于表达。

图6 pEXP1-DEST™ 和pEXP2-DEST™载体表4-Gateway™体外蛋白合成目的载体大肠杆菌表达大肠杆菌提供了几种有利于重组蛋白生产的优点，包括容易操作、生长迅速和培养基要求简单。

大肠杆菌非常适于表达用于抗体生产和结构研究的蛋白。

目前有很多具有不同启动子的大肠杆菌目的载体（表5），从而为您提供一系列表达选择。

Gateway™目的载体也会为您提供N端或/和C端融合标签的选择，从而简化表达蛋白的纯化和检测。

5－Gateway™大肠杆菌表达目的载体* 6xHis标签来自Qiagen授权酵母表达酵母是最简单的真核生物之一。

基因组了解清楚，生长迅速，并且非常适于大规模发酵。

由于酵母是真核细胞，它可以进行高等真核细胞的一些翻译后修饰，因而可以在廉价、易于操作的宿主中，为您提供一些哺乳动物表达的优点。

Invitrogen 的Gateway™酵母表达目的载体（表6）允许您利用酵母表达的优势生产目的蛋白。

表6-Gateway™酵母表达目的载体在酵母中进行功能分析除了在酵母中表达蛋白，现在用于研究蛋白－蛋白相互作用的ProQuest™酵母双杂交系统也是Gateway™-改造过的（表7）。

这种双杂交系统允许您：∙通过重组反应转移目的基因到bait载体或prey载体∙使用基于GAL4转录因子重建系统确定相互作用∙筛选完整文库或单一克隆∙通过提供低拷贝数质粒，具有独立启动子的三种报告基因，阳性和阴性对照，及一组扩展的酵母对照菌株降低假阳性率。

∙快速转移DNA序列进其它系统进行多种应用表7-ProQuest™双杂交系统* 3个载体全部是Gateway™-改造过的，而且具有att重组位点。