生工13级蛋白质与酶工程复习题二、分析与应用题1.酶在制造业、食品工业、制药、实验等众多领域有许多用处，但游离酶因生产成本高、不易回收、稳定性差，有时与产物混杂难以分离，用何种具体方法可以解决这些问题。

固定化酶：用物理或化学手段定位在限定的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利用的酶。

固定化细胞：将具有一定生理功能的生物细胞（如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等），用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。

2.目前固定化酶技术常用吸附法、包埋法、共价偶联法、交联法等多种方法，分析比较各自的优缺点。

1）.吸附法:依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。

优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。

缺点：结合力弱，易解吸附。

（2）共价偶联法：借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。

优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。

缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性（3）.交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。

优点：反应条件激烈，酶分子多个基团被交联，酶活力损失大。

缺点：制备的固定化酶颗粒较小，使用不便(4）包埋法（entrapment）：将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。

优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。

缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶3.分析模拟酶与天然酶的不同之处及优点，分析说明模拟酶为什么可以进行一些催化反应？天然酶的特点：优点：温和条件下，高效、专一地催化某些化学反应；应用于糖生物工业、能源工业、饮料产业以及医药行业。

不足：对热敏感、稳定性差、分离回收不易、来源有限，限制了天然酶的规模开发和利用。

模拟酶：是用有机化学方法设计和合成一些较天然酶更简单的非蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。

优点：既有酶催化的高效性，又能克服酶的不稳定性。

4 现有一段DNA序列，如果想改变其中某个碱基，可用什么方法，如何去做？5 如何理解酵母双杂交系统的原理？举例说明其在蛋白质相互作用研究中的应用。

p197-1996 重组体导入受体生物有哪些方法，举例说明4种导入方法及适用对象。

(1)裸DNA直接注射小鼠（2）脂质体转染法哺乳动物 (3)载体介导的转化方法植物(4)DEAE-葡聚糖转染法病毒(2)7 对蛋白质侧链中的几个特定活泼基团进行化学修饰时，主要有哪些修饰反应，各用何种修饰试剂？巯基的化学修饰反应：烷基化、酰基化、氧化还原。

修饰剂：碘乙酸、碘乙酰胺氨基的化学修饰修饰反应：酰基化与烷基化修饰剂: 三硝基苯磺酸、丹磺酰氯、 2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等。

羧基的化学修饰水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。

二硫键的化学修饰反应;还原修饰剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇8.目前几种大量筛选突变重组体方法有哪些，请说明其基本原理及应用过程。

三、简答题1．简述蛋白质工程的一般程序：①筛选纯化需要改造的目的蛋白②研究其特性常数等③获得蛋白质结构与功能相关数据:蛋白质一级及空间结构测定④蛋白质改造分析：结合生物信息学的方法进行分析⑤预测蛋白质的空间结构：由氨基酸序列及其化学结构，确定蛋白质结构与功能的关系，找出可修饰的位点和可能的途径⑥根据氨基酸序列设计核酸引物或探针，并从cDNA文库或基因文库中获取编码该蛋白质的基因序列⑦对编码蛋白质的基因序列进行改造，并在不同的表达系统中表⑧分离纯化表达产物，并对表达产物的结构和功能进行检测2. 组成蛋白质的常见氨基酸有哪些？可以将它们分成几类？脂肪族氨基酸芳香族氨基酸杂环氨基酸3 简述蛋白质一级结构（氨基酸序列）测定步骤：(1)测定蛋白质分子中多肽链数目；(2)拆分蛋白质的多肽链(分开亚基)；(3)断开多肽链内二硫键；(4)分析每一条多肽链的氨基酸组成； (5)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基； (6)裂解多肽链成较小的片段； (7)测定各肽段的氨基酸顺序；(8)片段重叠法重建完整多肽链一级结构；确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置4 简述分子伴侣的有哪些主要作用。

1)帮助新蛋白的折叠2）帮助蛋白质的跨膜转运3）是一些聚合蛋白解散4)催化不稳定的蛋白的降解5)控制调节蛋白的折叠，影响基因的转录6)参与细胞内囊泡的转运7)参与细胞骨架的装配5.突变文库的筛选方法主要有哪些？1）噬菌体展示技术2）核糖体展示技术3）细菌表面展示技术4）酵母表面展示技术6 基因融合技术或构建融合蛋白有哪些实际意义？①利于回收（衍生因子之一为亲和标签）；②产生新的多功能蛋白③利于检查和产物定位；④避免产物的快速溶解；⑤防止包涵体的形成⑥外源蛋白定位在宿主的不同区段；⑦融合蛋白再体外切割提高产量稳定性；⑧研究蛋白质结构。

7 简述酶分子化学修饰的基本原理。

利用化学修饰剂所具有的各种基团的特性，直接或间接的经过议定的活化过程与酶分子的某种氨基酸残基发生化学反应，从而对酶分子的结构进行改造。

8. 为什么环糊精及其衍生物可以作为模拟酶模型，该模型与大环冠醚模拟酶模型有何区别？环糊精(CD)由淀粉通过环糊精葡萄糖基转移酶降解制得。

CD的修饰：在CD两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结合和催化功能。

9 抗体酶有何催化特性？1、抗体酶与天然酶相比能催化一些天然酶不能催化的反应、有更强的专一性和稳定性、催化作用机制不同2、抗体酶和普通抗体相比更高的反应特异性、反应的可逆性、反应的量效性、反应过程10 简述抗体酶催化的反应类型有哪些？1、水解反应2、转酰基反应3、双烯加成反应（环加成反应）4、光诱导反应5 、氧化还原反应6、Claisen重排反应7、酰胺合成反应8、转酯反应9、脱羧反应10、顺反异构化反应11 简述分子印迹的基本过程。

⑴在一定溶剂中，模板分子与功能单体依靠官能团之间的共价或非共价作用形成主客体配合物。

⑵加入交联剂，功能单位复合物周围发生聚合反应⑶洗脱或解离聚合物中的模板分子14 简述有机溶剂对有机介质中酶催化的影响：⑴有机溶剂对酶结构与功能的影响⑵有机溶剂对酶催化作用的影响⑶有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响⑷有机溶剂对底物和产物分配的影响15 简述固定化酶的意义1）利用固定化酶可操作性强，可将其用于没的结构与功能的研究，多亚基酶和多酶体系组装方式的研究及凝血和血栓溶解的生化过程的研究等。

2）利用固定化酶在相界面催化反应的特点，还可以用它来复制酶膜的模型，将多酶系统包埋在微囊内，可用于酶系统的组装定位及代谢等基础理论的研究。

16 简述酶分子定向进化和定点突变的方法及定点突变的特点方法：重叠延伸PCR技术、快速定点突变特点：突变位点是确定的；突变的个数也是预知的；突变的效应往往是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的17 何为报告基因，报告基因需满足哪些条件？基因被克隆并且已知全序列；宿主不存在报告基因产物或类似产物；表达产物易被检测；报告分子的分析结果应具有很宽的线性范围；报告基因在细胞内表达对宿主正常的生理作用没有影响。

18 如何理解酵母双杂交系统的原理？举例说明其在蛋白质相互作用研究中的应用。

19 简述抗体酶的制备方法1、诱导法（细胞融合法）2、化学修饰法（引入法）3. 引入辅助因子法4. 用蛋白质工程技术5、拷贝法6、共价抗原免疫法7. 天然来源抗体酶20 简述反胶束的结构及反胶束体系中酶促反应的特点。

结构：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核特点：21 简述酶化学修饰的意义1）在生物医学领域：化学修饰可以降低免疫原性的免疫反应性抑制免疫球蛋白的产生。

2）在生物技术领域：酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效的发挥催化作用，并表现新颖的催化性能。

22 简述核糖体展示技术的操作过程。

通过PCR等方法扩增目的基因建立DNA文库，同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环，并置于具有耦联转录/翻译的无细胞翻译系统中孵育，是目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，并形成mRNA—蛋白质-核糖体三元复合体，利用常规的免疫学检测技术，筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用PCR扩增技术进行下一循环的富集和选择，最终筛选出高亲和力的目标分子。

23 简述大肠杆菌生产异源蛋白的优缺点。

优点：①大肠杆菌遗传特性了解清楚②已成功建立了适合的发酵技术③能不受限制地生产重组蛋白④经济前景很诱人缺点：①重组蛋白以包含体形式在细胞内聚集②不能进行蛋白质翻译后修饰:如糖基化、酰胺化或乙酰基化③重组蛋白与公众理念相悖24 简述质粒DNA有那些生物学特性寄生性、稳定性、同源性、重组性、不相容性、传递性、消除性、复制类性表现性、25 简述制作质粒克隆载体需要什么条件。

1）较高的拷贝数。

（2）具有较小的相对分子质量。

（3）带有可供选择的标记。

（4）具有复制起点。

（5）具有若干限制酶单一识别位点26 简述制作质粒表达载体需要什么条件。

1)能自主复制；(2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记；(3)具有能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别的强大启动子；(4)启动子应可受诱导调控；(5)具有强终止子；(6)具有翻译起始信号。

27 简述在基因工程中利用lacZ的显色原理。

在IPTG的诱导下，pUC载体合成β-半乳糖苷酶的α链，宿主产生β-半乳糖苷酶β链，将X-gal分解成蓝色物质，结果大肠杆菌为蓝色菌落。

外源基因插入pUC载体，使之不能产生β-半乳糖苷酶的α链，结果大肠杆菌为白色菌落。

28 简要回答影响酶催化作用的因素：1.底物浓度2.产物浓度3.酶浓度4.温度5.pH值6.抑制剂7.激活剂30 细胞破碎的方法有哪些？原理是什么？机械破碎法：高压匀浆破碎法、高速珠研磨破碎法、超声波破碎法物理法：渗透压冲击、冻结和融化、干燥法。

生物酶解法。

化学渗透法。

31 简述酶的提取方法及影响酶提取的主要因素。

酶的提取方法：盐溶液提取法、酸溶液提取法、碱溶液提取法、有机溶剂提取法影响酶提取的主要因素：温度、pH 、搅拌、污染、提取液的体积。

32 简述差速离心和密度梯度离心分离酶的原理及各自特点。

差速离心原理：操作时，选择好离心力和离心时间，使大颗粒先沉降取出上清液，在加大离心力的条件下再进行离心，分离较小的颗粒。

如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离。

特点：差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。

操作简单方便，但分离效果较差。

梯度离心原理：将样品在密度梯度介质中进行离心，从而使沉降系统系数很接近的颗粒分离开来的一种区带离心。

特点：不与分离组反应，不引起分离组分的凝集和变性失活。

33 简述双水相萃取和反胶束萃取的原理，举例说明它们在酶分离纯化中的应用。