• 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
• 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
三、新种分离与筛选的步骤
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 长培养特性。
• 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所
需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性
• 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样 采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋 和塑料瓶等。
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集
日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；
3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分 离培养时应加以考虑。
4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种 或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技 术。
富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变 来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如 以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富 集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。
5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调 节到与试样的生态系统参数值相近。
二、分离
• 目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速， 有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常 用平皿反应法：
• 纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
• 透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如 可溶性淀粉、碳酸钙等。 变色圈法：直接用显色剂或指示剂。 生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生 物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养 条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长， 形成生长圈。 抑制圈法：琼脂块培养法。
包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特 性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温 度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工 艺等。
菌种筛选主要步骤
• 调查研究及查阅充分的资料 ↓
设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境
采样 ↓确定特定的增殖条件
增殖培养 ↓确定特殊的选择培养基及可能的 ↓定性或半定量快速检出法
• 采样的对象也可以是植物，腐败物品， 某些水域等。
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
• 3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
• 二 根据微生物生理特点采样 1、根据微生物营养类型
2、根据微生物生理特性
• 三 特殊环境下采样
第三节 含微生物样品的富集培养
• 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性 培养基，选择一定的培养条件来控制。
一、控制培养基的成分 • 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维
素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那 么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长， 而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段 的纯种分离就会顺利得多。
• 二、控制培养条件 pH值的控制 细菌、放线菌：pH 7.0～7.5 酵母菌、真菌：pH 6.5～7.0
温度的控制
通气量的控制
• 三 抑制不需要的菌类
• 这一步是采用与生 产相近的培养基和培 养条件，通过三角瓶 的容量进行小型发酵 试验，以求得适合于 工业生产用菌种。
（五）毒性试验
• 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的， 将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品 工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定， 微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米 曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外， 其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒 性试验。
如使用不同类型的抗生素、高温、 高压等条件，抑制不需要的菌类。
第四节 微生物的培养分离
• 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
11.稀.稀释释平平皿皿分分离离法法
• 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应 贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因 为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离 了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生 变化，微生物群体之间就会出现消长
(二)生态学参数及培养基
的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境 生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶 剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。
第六章 微生物菌种的分离筛选
第一节 菌种分离的总体设计 第二节 分离样本的采样 第三节 含微生物样品的富集培养 第四节 微生物的培养分离
第一节 菌种的分离简介
一、菌种的来源
• 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买；
• 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、分离思路
• 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
用刚果红染色法鉴定筛选 降解纤维素的菌株
抗生素筛选
羧甲基纤维素钠作培养物
检定菌培养， 加上发酵液
五、放线菌的分离培养基的组成原则
• 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物 的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其 他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓 慢形成菌落。
• 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉 菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。
• 水中放线菌的分离： 为使所要分离的放线菌的数量 种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉 积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。
次代培养及纯化
• 菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异， 作初步的鉴定和区分。
• 通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子 形成情况。
• 成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是 所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而 肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定， 在分离放线菌时显得尤为重要。
2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须 含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然 提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源， 如几丁质、纤维素或果胶。
3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌 酮和制霉素)，掺加浓度一般为50μg／m1， 以 抑制真菌的生长。
4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、 2天。
平板分离 ↓
• 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条Hale Waihona Puke 筛选↓ 初筛（1株1瓶）
↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶）
↓ 3～5株
↓ 单株纯种分离
↓ 生产性能试验 ↓→毒性试验 菌种鉴定
第二节 分离样本的采样
1、采样对象 以采集土壤为主。
• 一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细 菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土 壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一 些野果生长区和果园内。
• 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点 是由于实验材料和琼脂都含有淀粉类物质，可以使能够 产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀 粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊,无明显影响.方法二 的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们 在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈， 与纤维素分解菌不易区分。短时间培养也无大碍。
(1)稀 释 1ml
1ml 1ml 1ml 1ml
1g
100ml 1/100
9ml
9ml
9ml
1/1000 10-4 10-5
9ml
10-6
9ml
10-7
9ml
10-8
1.稀释平皿分离法
a.倾注平皿分离法
b.涂布平皿分离法
2.平皿划线分离法 a. 连续划线分离法 b. 分区划线分离法
（四）筛 选
培养基的配制，干湿热灭菌，以及微生物分离纯化技术。 • 2.初步的科研训练：练习科研过程中查阅资料、设计实验
方案、动手实施方案、综合安排实验、解决临时实际困 难等方面的基本能力，认识科研程序，感受科研乐趣和 困难。 • 3.培养实事求是的工作作风，科学严谨的工作态度。
实验原理
纤维素与纤维素酶
• 纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包含三部分， C1,Cx,和葡萄糖苷酶组成。前两种使纤维素分解成纤 维二糖，第三种将纤维二糖分解成葡萄糖，正是在这 三种酶的协同作用下，纤维素最终被分解成葡萄糖， 为微生物的生长提供营养。
• 纤维素分解菌的筛选 纤维素-刚果红混合培养基
刚果红染色法
• 常用的刚果红染色法有两种：一是先培养微生物，再加 入刚果红进行颜色反应，二是倒平板时就加刚果红。
• 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶 液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色 反应基本上是纤维素分解菌的作用。
• 子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体 组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一 小块无菌滤纸上培养。
微生物菌种分离实例
分解纤维素的微生物的分离
实验目的 • 从土壤中分离能分解纤维素的微生物,纯化得到1-5株菌.
并通过此次实验,培养以下三方面的能力: • 1.基本技术训练：在目前专业课程学习基础上进一步练习
分离的微生物之生态系统或栖息地： • 3．将若干样本分成若干类型，如植物和植物各