酶切、片段回收与连接黄华如（生命科学学院，生技091，29号）摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。
本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。
说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。
关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。
构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。
对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。
基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。
基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。
近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。
现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。
这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。
尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。
当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落[1]。
1 材料与设备1.1 试供材料大肠杆菌、质粒DNA1.2 试剂准备质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T4连接酶、T4 Buffer、LB 固体培养基、等1.3 实验设备及用具高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。
2 实验步骤2.1 提取质粒DNA这个步骤由老师完成2.2 酶切表一：质粒（bt2）双酶切体系表二：质粒（pet）双酶切体系试剂用量试剂用量Buffer 2ul Buffer 2ul质粒（bt2）4ul 质粒（pet）4ulBam1HI 1ul Bam1HI 1ulHindIII 1ul HindIII 1ulWater 12ul Water 12ul总体系20ul 总体系20ul酶切2h以上，酶切结束后，用1.2%琼脂糖检查双酶切效果。
2.3 片段回收1)使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。
胶块超过300mg时，请使用多个Column 进行回收，否则严重影响收率。
注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3)切碎胶块。
胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。
4)称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1mg=1ul进行计算。
5)向凝胶中加入胶块融化液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：凝胶浓度Buffer GM使用量1.0% 3个凝胶体积量1.0%-1.5% 4个凝胶体积量1.5%-2.0% 5个凝胶体积量6)均匀混合后室温15-25℃融化凝胶。
此时应间断震荡混合，是胶块融化（约5-10分钟）。
7)当凝胶完全融化后，观察融胶液的颜色，如果融胶液颜色有黄色变为橙色或粉色，向上述胶块融化液中加入10ul 3 M醋酸钠溶液（pH5.2），均匀混合至溶液恢复黄色。
当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9)将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
10)将700ul 的Buffer WB 加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
11)重复操作步骤10。
12)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心1分钟。
13)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30ul的灭菌蒸馏水或Elintion Buffer，室温静置1分钟。
14)室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
2.4 T4连接酶连接表三：T4连接酶连接体系试剂用量回收pet质粒4ul回收bt2质粒4ulT4 连接酶1ulT4 Buffer 1ul总10ul放置4°C连接过夜2.5 转化大肠杆菌质粒DNA转化大肠杆菌方法：1)把感受态细胞置于冰中；2)把50ul的感受态细胞转至连接的DNA中（10ng一下，昏匀）；3)冰中放置30分钟；4)42°C放置45--60秒；5)冰中放置2--3分钟；6)加入37°C预热更好的soc培养基，使终体积1ml；7)37°C振荡培养1小时（160--225r）8)取适量的菌液涂布琼脂糖培养基9)37°C过夜培养2.6 验证（PCR）表四：验证PCR体系试剂用量10xBuffer 2uldNTP 2.5ul引物1 0.5引物2 0.5ulTaq酶0.5ul加蒸馏水至25ulPCR条件：94℃4min，94℃45s，51℃45s，72℃1m30s，30个循环，72℃10min。
3 结果分析3.1 酶切结果（M：Maker2000；B：bt2质粒；P：pet质粒；1，2，3···：每组实验）图1 两种质粒的双酶切结果在图1中可以清晰的看到，bt2质粒被酶Bam1HI和酶HindIII切成两条带，而pet质粒则被切成一条带，在bt2质粒中，第一条较粗的带为目的基因，第二条是双酶切切除目的基因后剩下的基因；在pet质粒中，可以看到的只有一条带，其实在双酶切下，pet质粒也会有两条带的，只不过是切完后的两段片段的质量差不多，在电泳的时候没能跑开来。
由于bt2和pet质粒都是用相同的两种酶剪切，所以在在bt2质粒和pet质粒剪切下来的目的片段和载体片段都形成了相同的粘性末端。
我们每组的结果都很清晰很成功，只要成功的地方很有可能是bt2质粒和pet质粒的质量都非常高。
3.2 转化大肠杆菌结果图2 质粒DNA转化大肠杆菌图2中可以清晰的看到白色的斑点，转化的大肠杆菌。
由于目的基因中含有一些抗性基因，如，Amp、潮霉素等，而在培养基中也加有这如Amp、等的抗生素，能在培养基生长的细菌，它们的基因组里面应该是含有抗性基因的。
从图中可以看到很多白色的斑点，能够正常生长的大肠杆菌，这些大肠杆菌中成功的转入了含有bt2质粒的目的基因。
但是，这些白色的斑也有可能是假阳性，为了确定目的基因是否真正的转入大肠杆菌，还需要做PCR 验证。
3.3 验证的PCR结果（M：maker2000；1-6：本组大肠杆菌结果；7-8：老师提供大肠杆菌结果）图3 验证转化大肠杆菌PCR电泳图谱图3中，白色方框内的为1班6组的结果，左边的六个孔是点用自己转化大肠杆菌PCR 的结果产物，右边两个点是老师提供转化大肠杆菌PCR的产物，可以看到，我们自己转化的大肠柑橘在电泳图中没有跑出来，而老师提供的大肠杆菌就可以跑出来。
说明了我们自己转化的大肠杆菌虽然在抗生素培养基生存，但那是假阳性的大肠杆菌，而老师提供的大肠杆菌是成功转入了目的基因的阳性大肠杆菌。
4 讨论与分析4.1 讨论本实验所涉及的内容和步骤都非常多，有很多环节都是要注意的，这关系到整个实验的成功与失败，例如下面的这些：1)感受态细胞非常脆弱，要轻拿轻放，不能过分的摇晃，更不能激烈震荡；2)在做酶切和PCR过程中，尽量在冰上操作，保持低温环境；3)在进行加样的时候要有耐心，因为进行双酶切时加入的物品的量都是比较少的，所以要特别留意。
特别是在把取出的样品加入到PCR管的时候更要注意，因为量太少，所以要粘着PCR的管壁来放样；4)转化实验中所使用的玻璃仪器，微量吸管，离心管等应该彻底清洗干净，并进行高温高压消毒灭菌，表面去污剂、化学试剂的污染残留会大大减低转化率。
微量吸管应该剪去尖端扩大口径。
4.2 分析质粒的重组和转化是基因工程的关键所在，所谓的基因的工程就是将真核细胞的基因能在原核细胞中成功地表达，这个实验通过质粒的重组和转化，这对基因工程的研究很有帮助的。
在基因工程中，目的基因获取的途径有很多：从基因文库或cDNA文库中获取所需的目的基因；更具目的基因的序列来合成所需的目的片段；通过PCR扩增技术来获得所需的目的片段。
而本实验就是通过PCR扩增技术来获取质粒DNA的，在进行电泳检测目的基因，可能会出现无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性、假阴性的现象。
参考文献：[1] 梁红，梁雪莲. 生物技术综合实验教程[M]. 北京：化学工业出版社，2010.。