生物制品技术实验指导生物工程系目录实验规则 (2)实验一、猪瘟、口蹄疫抗体间接血凝实验 (3)实验二、鸡新城疫灭活疫苗的制备—照蛋及接毒 (4)实验三、鸡新城疫灭活疫苗的制备—鸡胚收毒及测效价 (5)实验四、鸡新城疫灭活疫苗的制备—油乳苗的制备 (6)实验五、氢氧化铝和蜂胶的制备 (7)实验六、法氏囊炎病高免卵黄抗体的制备 (8)实验七、法氏囊炎病高免卵黄抗体效价的测定 (9)实验八、兔瘟灭活苗的制备 (10)实验九、大肠杆菌自家灭活疫苗的制备 (11)实验十、动物实验 (12)实验十一、鸡白痢平板抗原的制备及使用 (15)实验十二、免疫血清的制备 (16)实验十二、细菌冷冻真空干燥实验 (18)1实验规则实验中所用材料，多具有传染性（如病原微生物、含病原微生物的血、尿、便、痰、脓汁及感染动物等），在实验过程中，必须严肃认真地进行无菌操作，以保证结果准确，防止实验室感染，防止病原微生物污染环境。

必须遵守以下各项。

1、实验前必须预习实验指导书。

若经提问发现没有预习者，须在教师指定的时间内预习完毕，方得参加实验。

、进实验室不得将书包、衣物等放在实验台上，不必需的物品勿携入室内。

2、实验室内严禁饮食、吸烟及用嘴舔湿铅笔及瓶签，、如发生感染或污染等意外时，应立即报告指导老师，进行紧急处理。

5、保持实验室安静，不得谈笑喧哗，不许搞其他动作，以免影响他人实验。

实验进行时不准随意进出。

实验室中物品未经许可不准带出室外。

6、清洗仪器、用具、材料时，须将固形物倒入指定容器内，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。

7、实验过程中，须按操作规程仔细操作，注意观察试验结果，应及时记录。

不得抄写他人的实验实习记录，否则，须重做。

如有疑问，应向指导教师询问清楚后方可进行。

8、实验完毕后，须将玻璃仪器、用具等清洗干净，按原来的位置摆设放置，如有破损须报告指导教师，并填写仪器损坏登记簿。

关好门窗水电，用消毒液洗手后离去。

10、实验结束后，由值日生负责打扫实验室，保持室内整洁，注意关上水、电、窗、门。

2实验一猪瘟（HC）、口蹄疫（FMD）抗体间接凝集试验一、目的要求：掌握正向间接凝集反应原理及操作方法。

二、原理：将病毒抗原吸附于醛化红细胞上，带抗原的红细胞可以和抗体发生凝集，从而可以检测被检猪的相应抗体水平。

三、材料：微量反应板、移液器、滴头、HC诊断抗原、FMD诊断抗原、被检血清、阳性血清、阴性血清各一瓶、生理盐水、微量振荡器、胶布适量。

四、方法步骤：1、用移液器加滴头吸生理盐水。

加入微量反应板孔内一排8孔，每孔加50微升。

2、换一滴头吸一被检血清从第一孔加入50微升，吹吸3次（1：2）吸此孔液体到第2孔，吹吸3次，（1：4），依次类推倍比稀释至第8孔，第8孔再弃去50微升。

这样每孔均为50微升，稀释度分别为1：2、1：4……1：256。

3、换一滴头吸HC诊断抗原各25微升，分别加入第4孔、第6孔。

4、换一滴头吸FMD诊断抗原各25微升，分别加入第5孔、第7孔。

5、每组做1份对照：在反应板最后一排分别滴阳性血清、阴性血清各2孔，并分别加HC、FMD诊断抗原各25微升。

6、在微量振荡器上振荡2min，室温下（25-30℃）1.5—2h观察。

7、其他同学重复做1—4步。

8、贴胶布、标明被检血清、组别、对照等。

9、结果判断：HC抗体凝集（++）1：16以上为合格；FMD抗体1：128以上为合格。

五、思考题：1、正向间接反应的原理是什么？2、该试验应注意哪些事项？如何判定自己做的结果准确？3、当结果出现错误时，有哪些原因造成的？3实验二鸡新城疫灭活疫苗的制备——照蛋及接毒一、目的要求：通过试验掌握鸡新城疫灭活油乳疫苗的制备方法。

二、原理：新城疫病毒可以在鸡胚中生长、并引起病变和鸡胚死亡。

收胚胎尿囊液毒后，可以利用血凝实验测定效价（NDV病毒具有血凝素，可自动凝集红细胞）。

符合标准后灭活、加佐剂可制成灭活疫苗。

三、材料：孵化10天的受精鸡胚、照蛋器、新城疫II系和IV系疫苗、生理盐水、1ml注射器、石蜡、滴头、注射针头、酒精棉球、镊子。

四、方法步骤：1、将鸡胚先照蛋、画出气室，用酒精棉球消毒接种部位、离气室边缘1cm（避开血管），先用消毒针头钻破蛋壳，然后针头与蛋成30度角进针0.5cm注入0.1mlNDV，1-4组接II系毒种，5-6组接IV系毒种，标记，每2人1个鸡蛋、接种后封蜡。

2、毒种的准备：将疫苗按1羽份0.1ml稀释，然后加入青链霉素溶液，使之达到含500单位青链霉素/ml，接毒时按0.1ml病毒液/枚蛋接种。

3、接毒后的鸡胚放入孵化箱中，37.5℃孵化，24h挑出死胚蛋弃去，其它继续孵化，以后每半天观察1次，挑出死胚，放入4℃冰箱冷藏，到96—120h不论是否死亡都放4℃冰箱冷藏1天。

五、思考题：1、如何确定鸡胚的死活？2、鸡胚接种有几种方法？日龄是多少？4实验三鸡新城疫灭活疫苗的制备——鸡胚收毒及测效价一、目的要求：掌握新城疫病毒血凝实验操作方法。

二、原理：新城疫病毒有血凝素，可以凝集鸡的红细跑，通过测血凝效价，知道尿囊液中病毒的含量。

三、材料：无菌吸头、脱脂棉、无菌剪子、镊子、无菌烧杯、微量反应板、0.5%鸡红细胞、移液器、滴头、离心机、生理盐水、酒精棉球。

四、方法步骤：1、提前准备0.5%鸡红细胞（鸡的抗凝血加生理盐水离心洗涤5次，3000转/分、最后配成0.5%红细胞）。

2、将气室用酒精棉球消毒、剪开气室、剪开尿囊膜、用吸头吸尿囊液于烧杯中（可垫少量脱脂棉花，防堵吸头。

）3、测效价：(1)取一微量反应板用移液器吸生理盐水，按第1-12孔各加加50微升。

(2)换1个滴头吸被检尿囊液50微升放于第1孔，吹吸3次，再吸此孔50微升到第2孔，依次类推，最后到11孔弃去50微升。

稀释度分别为1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048。

(3)空白12孔生理盐水50微升，做阴性对照。

(4)1—12孔各加入0.5%红细胞50微升，阴性对照也加入50微升0.5%红细胞。

(5)在微量振荡器上振荡2min，放入湿盒中，25℃、15min后开始观察到60min。

(6)判定病毒血凝效价，记录。

4、将尿囊液按每ml加500单位青链霉素，杀菌、4℃保存，同时加入0.1%甲醛灭活，4℃1天。

（一般合格弱毒疫苗病毒效价在1：512以上）。

5、尿囊液冰冻保存。

留做灭活油乳苗用。

五、思考题：1、记录你测的血凝效价是多少？是否合格？2、为什么血凝试验可测鸡新城疫病毒的效价？5实验四鸡新城疫灭活疫苗的制备—油乳苗的制备一、原理：油类是非特异性免疫佐剂，通过一定方法将水剂灭活疫苗和油类乳化在一起，可提高该疫苗的免疫效果。

二、目的要求：要求学生掌握灭活油乳苗的制备方法。

三、材料：白油、吐温-80、司本-80、硬脂酸铝、新城疫灭活水剂苗、高速捣碎机、量筒、烧杯、离心机、1ml吸管、离心管。

四、方法步骤：1、预准备：油相：将白油中加入2%硬脂铝酸、6%司本-80、加热溶化（160-170℃半小时），分装500ml瓶中，116℃灭菌30min，备用，同时灭菌吐温-80。

2、制水相：将水剂疫苗中加入4%吐温-80，高速搅拌2-5min。

3、乳化：将油相加入捣碎机中，缓慢搅拌，慢慢加入水相（1：1或1：2，水：油相），然后高速搅拌5min，即成。

4、检查：（1）黏度检查：吸1ml油乳苗放出（垂直）0.4ml为15s，此为适用黏度。

（2）稳定性：3000r/min离心15min不分层。

六、作业：1、记录操作方法和过程。

2、油水能乳化在一起的原理是什么？3、你做的油乳苗性能是否符合标准？影响因素有那些？6实验五氢氧化铝胶和蜂胶的制备一、原理：明矾水和氨水起反应生成铝胶。

铝胶是一个比较好的免疫佐剂，具有吸附沉淀、包埋作用、可增强免疫效果。

蜂胶的溶解和测定等级二、目的要求：要求学生掌握氢氧化铝胶的制备方法。

2KAI（SO4）2•12H2O+HN4OH——2AL（OH）3+K2SO4+3（NH4）+24H2O三、材料：明矾、水桶、电炉、氨水、搅拌器、PH纸、纱布、棉花。

四、方法步骤：1、明矾水的准备：先将明矾砸碎，将水烧至80℃左右，将明矾按20%加入、搅拌、溶化、澄清10-30分钟、虹吸上清液纱布棉花过滤。

2、合成：将60℃的明矾水搅拌，边搅边加入氨水（缓慢加入），当出现浓稠时，PH约8左右，停止加氨水。

3、打碎混匀。

将已合成胶放入打碎机中，打磨2遍。

4、洗去SO4²ˉ离子：将胶放入水桶1/4—1/5，补充干净水（纱布棉花过滤）到满桶，每天澄清1次，同时倒去上清水，再补充水，连续4次，以洗去SO4²ˉ。

5、将制成胶装500ml瓶，高压灭菌备用。

五、示教：磷酸三钙制备先配20%磷酸氢二钠和20%氯化钙灭菌。

在灭活菌液100ml中加入2.5ml20%氯化钙，摇匀，然后缓慢加入20%磷酸氢二钠7.5ml，搅拌匀，即成絮状磷酸三钙佐剂疫苗。

六、蜂胶制备：1)酒精融化：一班称50克蜂胶，4度下砸碎，倒入200毫升95%酒精中融化24h。

2)第2天滤纸过滤，渣滓45度烘干，第3天称重，算出蜂胶等级，以及每毫升7酒精蜂胶含量。

3)使用，按疫苗每毫升加10mg，摇匀。

六、作业：1、铝胶佐剂有何优缺点？2、记录铝胶制作过程。

3、你测的蜂胶等级是多少？8实验六法氏囊炎病高免卵黄的制备一、目的要求：掌握法氏囊病高免卵黄抗体的制备过程和技术。

二、原理：鸡蛋蛋黄中有卵黄抗体，通过人工免疫母鸡法氏囊疫苗多次，卵黄中就有较高的法氏囊炎病毒的抗体，提取该抗体，就可以用于治疗和预防鸡法氏囊炎病。

三、材料：法氏囊炎油乳灭活苗、捣碎机、高免鸡蛋、青霉素、链霉素、纱布、0.1%新洁尔灭、水桶、生理盐水。

四、方法步骤：1、免疫母鸡：提前1个月用法氏囊油乳灭活苗免疫鸡3次，每次1.5ml，10天免疫1次，最后免疫后到10天收蛋，测效价、符合1：128以上即可制法氏囊卵黄抗体。

2、洗高免鸡蛋：将高免鸡蛋置0.3%新洁尔灭溶液中，擦洗消毒、凉干。

3、分离蛋黄：将高免鸡蛋打开两瓣，将蛋清倒入桶中，留下蛋黄备用。

4、制高免蛋黄液：按蛋黄和生理盐水1：3比例制备，先将8个蛋黄约120ml倒入捣碎机中，开机10秒打匀，停机加入约360ml生理盐水并加各20万青、链霉素，再捣碎开机1-2秒，一层纱布过滤分装于无菌瓶中，即成。

零下5-10℃保存。

若有鸡发生法氏囊炎病，按1-2ml/kg肌肉注射该抗体，即可起到治疗和预防作用。

五、思考题：1、制高免卵黄为什么要选用健康母鸡接种？2、制的高免卵黄为什么要加青、链霉素？9实验七法氏囊炎高免卵黄抗体效价的测定一、目的要求：掌握法氏囊炎高免卵黄抗体效价的测定方法。