脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2(1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019;3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006)摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。
方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。
结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。
结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。
关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03THE ISOLATION PURIFICATION ANDCULTURE OF HUCA MSCsCHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling,LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li(1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz houUniversity ,Suz hou,Jiangsu ,215006)ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbilical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs.KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem收稿日期:2003-12-16基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。
12实用临床医药杂志Journal of Clinical M edicine in Practice2004年第8卷第1期cells,M SCs)。
脐血间充质干细胞作为一种具有全能干细胞特点的细胞,为中胚层发育的早期细胞,具有多向分化潜能,其形态和生物学特点与骨髓源性M SCs相似。
国内外已有大量的实验证实骨髓间充质干细胞不仅能分化为造血实质,支持造血,还可向中胚层和外胚层来源的组织分化,在一定的实验条件控制下可分化为肌细胞[1]、成骨细胞[2,3]、脂肪细胞[4]、神经细胞[5]、肝细胞[6]、心肌细胞[7]等。
由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能,且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势,故寻找一种能替代骨髓MSCs,并可弥补其缺陷的间充质干细胞,已成为各国学者研究的热点。
目前研究证实脐血中存在的间充质干细胞在一定条件下进行体外培养和诱导分化后也能成为神经细胞[8,9](神经元和神经胶质细胞)、心肌细胞[10]等,可作为细胞治疗的新的种子细胞和基因治疗的新的载体细胞。
与骨髓相比,脐血有更充足的来源,脐血的免疫原性较弱,能耐受更大程度上的H LA配型不符,其M SCs更为原始,扩增能力更强,故脐血干细胞的作用越来越突出,可作为一种新的替代细胞来源用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗。
1 材料与方法1 1 脐血的收集和单个核细胞的分离无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血40 ~60ml,肝素浓度为20U/m l抗凝。
所有样本均于采集后12h内分离。
用Hank s平衡盐溶液1 1稀释、混匀,叠加于Ficoll H ypaque上,相对密度为1 077g/L,稀释血与Ficoll Hypaque液的柱高比为2 1,以2000r/m in离心20m in,取界面层的单个核细胞,加H ank s平衡盐溶液离心、洗涤2次,加入培养基中,调整细胞浓度106/ml左右。
1 2 细胞的培养、纯化及扩增培养基采用Mesencult T M培养液(Stem Cell 公司),并调整其pH值偏酸性,加入1%Pen strep(Gibco,Grand Island,NY),将细胞分装于25T培养瓶中,置于37 、饱和湿度、体积分数为5%CO2的培养箱培养48~72h后,更换培养液,弃去未贴壁的细胞,根据细胞生长情况,每3~5d 半量换液1次。
待细胞达到80%~90%融合时,用1 1的2 5g/L胰蛋白酶和0 2g/L EDTA混合液消化,然后按2 1的比例进行传代接种培养,并记为P1代。
传代培养过程中每3d半量换液,直至贴壁细胞彼此融合、铺满瓶底,再重复上述操作,传代培养记为P2代,余类推。
1 3 流式细胞仪检测取P3代脐血MSCs,去掉培养液,PBS洗2遍,用1 1的2 5g/L胰蛋白酶和0 2g/L EDTA 混合液消化,用含2%BSA的PBS洗涤后制成浓度为106/ml的单细胞悬液,与抗CD29、CD44、CD166、CD34、CD45抗体(Phar Mingen)室温反应30min。
PBS洗涤2次后与FITC标记的二抗避光反应15min。
细胞洗涤后悬浮于PBS中,流式细胞仪检测。
2 结 果2 1 脐血M SCs的分离与体外培养该研究中建立了M SCs分离及体外纯化、扩增的方法。
即以Ficoll H ypaque液梯度离心,从脐血中分离单个核细胞,将之接种于偏酸性的间充质干细胞培养基(Mesencult T M)中,48~72h 后出现贴壁的间充质样细胞,并有集落形成,同时有大量的破骨样细胞混杂(图1)。
破骨样细胞胞体较大,多个核,圆形。
M SCs为成纤维样的长梭形细胞,单个核,有较长的突起,折光性强。
随着在条件培养基的环境下培养,4~5周后细胞生长达80%~90%融合。
传至P3代后,大部分细胞(包括破骨样细胞)逐渐被去除,剩下形态较为单一的成纤维样细胞,即为脐血源性的MSCs(图2),形态上类似于骨髓MSCs,将这些细胞再次传代培养,1~2周左右可达到融合,并表现出较强的传代扩增能力。
2 2 MSCs表面抗原特性流式细胞仪检测结果显示:脐血MSCs均稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD166,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45,这与源于骨髓的MSCs的表面抗原标记相一致。
3 讨 论目前,对于脐血M SCs的存在及能否传代扩增,仍有较大争议[11]。
而其在体外培养过程中,由于破骨样细胞的存在,能否得到较为均一的MSCs,也成为制约脐血M SCs应用的障碍。
本实验旨在为脐血MSCs体外分离、纯化、扩增,探索一条更为有效、可行的途径。
所选用的13第1期陈 镭等:脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养图1 细胞接种24h后相差显微镜所见40图2 细胞接种2周后相差显微镜所见 40M esencult TM培养基提供了M SCs最佳的生长条件,能促进脐血M SCs增殖,保持其未分化状态,抑制其它贴壁细胞生长。