细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。

借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。

• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。

e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。

f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。

继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。

b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。

c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。

e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

（4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次。

b.静置，吸去上清，用平衡盐溶液漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。

c. 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞浓度到5×105/ml左右），37℃下培养。

（注意：省略了离心、计数等步骤）一、实验器材：手术小直剪刀三把、眼科直镊子三把、眼科弯镊子两把、玻璃平皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管和手术刀片。

以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、实验试剂：无Ca+2和Mg+2的PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纤维细胞（MEF）生长培养基:高糖DMEM加10%FCS。

`三、实验动物：孕期14至16天的孕鼠四、实验步骤：1. 处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30MLPBS的50ML离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS 将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其细细切碎。

3.用200ul的移液枪反复快速吹打平皿中的液体，放在15ML离心管中，4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，加10ML胰酶，重悬沉淀，放37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4.将上层细胞悬液倒入一装有10MLMEF生长培养基的50ML离心管中，用200目尼龙滤网过滤后，1500rpm离心5分钟收集细胞。

30ML MEF生长培养基洗涤两次（此步骤中作者试过用无血清的培养基洗涤，结果无差别）。

5.细胞沉淀用15ML生长培养基悬起，细胞计数（八只14天胎鼠可获得2-3×107细胞）。

6细胞悬浮于15ML MEF生长培养基中，接种到200ML的培养瓶中。

7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8 E. n8.细胞长满后，先用PBS冲洗，倒掉，加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟），按1：5传代9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存。

（冻存液要现配）4五、实验结果：六、讨论：1.原代培养，一定要避免污染。

" i+ K1 h# d$ i4 S6 y6 o3 F2. MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。

3. 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。

4. 消化细胞时间不要过长小鼠胚胎干细胞培养实验步骤1、一般培养——保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代2 、体外分化培养基：包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。

不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。

为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。

建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0. 1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。

将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活*。

下文中暂不提及Feed细胞。

Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。

分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。

通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。

贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。

然而，二甲基亚砜对细胞有毒*，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：1、从液氮中取出一管细胞；2、将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3、将细胞转移到一15ml Falcon管中；4、加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5、离心3分钟；6、弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7、种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8、孵育。

冻存细胞冻存液：90％HS和10％DMSO步骤：1、1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；2、用细胞刮刀收集细胞；3、将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；4、弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。

）5、分装于冻存管内，每管1ml；6、置－80℃过夜，第二天移入液氮。

Geltin（明胶）包被准备500ml 0.1％geltin溶液1、将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。

2、最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。

包被培养板或培养皿1、加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。

）；2、置室温30分钟；3、去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。

细胞传代建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。

纯化步骤包含在下面的方法中。

1、去除培养液；2、无钙镁PBS（Gibco）洗涤；3、加入胰酶EDTA（Gibco）。

37℃孵育5分钟。

4、加入ES培养基使胰酶失活；5、将细胞转入15 ml离心管中离心3min；6、去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。

如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。

ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。

这样可能会减少细胞的自然分化。

7、将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；8、含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。

吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）9、建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC)保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。

当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。

体外分化胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。

我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。

细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。

一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。

时间线（总时间为27～34天）第2步；4＋1天第3步；4－10天第4步；4天第5步；10－15天体外向心肌细胞方向分化胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。

培养基EB配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。