临床微生物学检验复习重点第一章生物安全和医院感染1.实验室生物安全保障：指单位和个人为防止病原体或毒素丢失、被盗、滥用、转移或有意释放而采取的安全措施。

2.医院感染（NI）：在医疗机构中获得的感染。

包括外源性和内源性，外源性来自于另一感染者/环境内源性：患者，正常菌群迁徙至其他部位等导致病原体过度生长。

第二章临床微生物检验标本的采集1.标本的一般采集原则1.1早期采集病程早期、急性期或症状典型时，使用抗生素或其他抗菌药物之前。

1.2无菌采集：采集的标本应无外源性污染。

消毒，无菌容器。

1.3根据目的菌的特性用不同的方法采集1.4采集适量标本伤寒-1周：血液 2周：粪便和尿夜1.5安全采集2.厌氧菌：在有氧条件下不生长，在无氧条件下生长的细菌。

2.1厌氧菌感染的条件：组织缺氧或氧化还原电势降低→原因：局血障：血管损伤、肿瘤压迫、烧伤、动脉硬化、组织水肿、坏死、有异物等，刺伤，大面积外伤2.2厌氧菌感染的临床特征（1）分泌物具典型的腐臭，血性渗出物呈黑色。

在紫外线下可发红色荧光(产黑色素普氏菌或卟啉单胞菌感染)。

（2）感染组织局部有大量气体产生→皮下有捻发音时为产气荚膜梭菌。

（3）部位为黏膜附近（4）长期使用氨基糖苷类抗生素无效者，新近流产史，胃肠术后（5）深部外伤枪伤，咬伤后继发感染（6）分泌物经革兰染色后，有细菌，规培：阴性液体及半固体培养基深部生长第三章临床细菌学检验技术1.细菌形态学检查→显微镜检其菌体形态1.1涂片 1.2干燥 1.3固定1.4 染色：（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

（3）（3）脱色：将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒，立即用水冲净酒精。

（4）复染：用复红液染1—2分钟，水洗。

1.5镜检：干燥后，置油镜观察。

革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。

固定的目的①杀死微生物，固定其细胞结构；②保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉；③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。

实验原理细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。

经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步结果是一样的，但在G+细胞中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘的复合物分子太大，不能通过细胞壁，保持着紫色。

在Gˉ细胞中，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的复合物从细胞中渗漏出来，当再用衬托的染色液复染时，显现红色。

红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，红色显示不出来2.细菌分离培养及鉴定→培养基培养，生化反应鉴定3.细菌的非培养→免疫学检测分子生物学检测毒性检测动物实验第四章细菌的耐药性检测1.抗菌药物敏感试验的意义（AST)：（1）可预测抗菌治疗的的效果（2）指导抗菌药物的临床应用（3）发现或提示细菌耐药机制的存在（4）监测细菌耐药性2.敏感（s）：所分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制。

3.耐药（R）：指所分离菌株不被测试药物常规剂量可达到的药物浓度所抑制。

4.中介（I）：抗菌药物在生理浓集的部位具有临床效力，还包括一个缓冲区，以避免微小的、不能控制的技术因素造成重大的结果解释错误。

5.纸片扩散法（M-H培养基、琼脂厚度：4mm）原理：纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。

在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。

不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小方法：（1）接种：用无菌棉拭子蘸取菌液，均匀涂布（2）贴抗菌药物纸片：无菌镊子各纸片中心相距>24mm，纸片-平板边缘>15mm（3）孵育35℃16-18h结果判读和报告量取抑菌圈直径，根据CLSI标准，判断“敏感”、“耐药”、“中介”6.微量肉汤稀释法1.2.1.抗菌药物和培养基制备同常量肉汤稀释法。

1.2.2.MIC板制备无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。

1.2.3.接种物制备（步骤）将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经M-H肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。

此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。

1.2.4.结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。

当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显长试验才有意义。

当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。

如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。

通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。

7.细菌的耐药机制1.产生灭活抗生素的各种酶（水解酶，钝化酶，修饰酶）【专一性】2.改变药物作用靶位【专一性】3.细胞膜透性下降（细菌生物被膜的形成和通道蛋白的丢失）【无专一性】4.细菌主动外排系统的过度表达【无专一性】第七章球菌需氧或兼性厌氧：葡萄球菌、肠球菌、链球菌等G+专性厌氧：消化球菌科球菌需氧或兼性厌氧：奈瑟菌属、莫拉菌G-专性厌氧：韦荣球菌科一、葡萄球菌：存在于皮肤粘膜上（白色、金黄色、柠檬色）1.G+2.葡萄球菌无鞭毛，无芽孢，体外培养时一般不形成荚膜。

3.在血琼脂平板上，有的菌株菌落周围形成明显的全透明溶血环（β溶血），溶血菌株大多有致病性。

4.致病物质：凝固酶、耐药核酸酶、透明质酸酶、磷脂酶、葡萄球菌溶素、杀白细胞素、肠毒素、表皮剥脱毒素、毒性休克综合征毒素-1凝固酶有两种：游离凝固酶－血浆凝固；结合凝固酶－细菌凝聚。

导致β溶血的是α溶素。

表皮剥脱毒素可引起SSSS，又称剥脱性皮炎。

5.所致疾病：（1）菌群失调性假膜性肠炎：长期使用广谱抗生素。

（2）皮肤化脓性感染：毛囊炎、疖、痈、伤口化脓、脓肿（3）器官化脓性感染：气管炎、肺炎、心包炎、心内膜炎（4）食物中毒（呕吐）、毒性休克（猩红热）、烫伤样皮肤综合征（婴幼儿、免疫力低下）、（5）医院感染6.葡萄球菌A蛋白（SPA）：菌细胞壁的一种表面蛋白。

7.金黄色葡萄球菌：血琼脂-透明溶血环，10%-15%NaCl生长，甘露醇高盐平板上为黄色菌落、耐干燥，抵抗力强，测定macA可快速检出。

生化反应：触酶阳性、动力阴性、凝固酶阳性、耐热核酸酶试验阳性、肠毒素试验（幼猫：呕吐腹泻/死亡）阳性8.标本采集：化脓性病灶采取脓汁、渗出液；疑为败血症采取血液；脑膜炎采取脑脊液；食物中毒则分别采集剩余食物、病人呕吐物和粪便等。

9.致病性葡萄球菌的鉴定主要根据产生凝固酶和耐热核酸酶，产生金黄色色素，有溶血性。

发酵甘露醇等作为参考指标。

二、链球菌属基本知识点：1.G+2.根据溶血现象分类：甲型溶血性链球菌菌落周围有1～2mm宽的半透明的草绿色溶血环，称甲型溶血或α溶血，这类菌也称草绿色链球菌。

α溶血环中的红细胞并未完全溶解。

这类链球菌多为条件致病菌。

乙型溶血性链球菌菌落周围有2～4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，称乙型溶血或β溶血，β溶血环中的红细胞完全溶解，这类菌也称溶血性链球菌。

这类链球菌致病力强。

丙型链球菌不溶血，不致病。

3.青霉素是链球菌感染的首选药。

4.致病物质：链球菌溶素、致热外毒素、透明质酸酶、M蛋白、链激酶、链道酶、F蛋白。

链球菌溶素有两种：O（SLO)和S(SLS)。

致热外毒素也称红疹毒素或猩红热毒素，是人类猩红热的主要毒性物质。

5.所致疾病：A群链球菌可分成侵袭性、毒素性、变态反应侵袭性：蜂窝组织炎、菌血症、急性淋巴管炎（菌血症、脑膜炎无乳链球菌）草绿色链球菌是人体口腔、消化道、女性生殖道的正常菌群，可引起：亚急性细菌性心内膜炎毒素性：猩红热变态反应：风湿热、急性肾小球肾炎、6.基本特征：肺炎链球菌：矛尖状7.培养特性：肺炎链球菌和草绿色链球菌需要CO2，营养要求高，加血液或血清血平板：灰白色，透明，表面光滑，小菌落牛型链球菌：无溶血性环，呈灰色菌落。

液体培养基表现为絮状和颗粒沉淀。

肺炎链球菌因荚膜多糖使菌落呈黏液状，因产生自溶酶，在平板上培养48小时后出现中心凹陷的“脐窝”状菌落----自溶产生8.标本采集：咽拭子、痰液、脓汁、血液9.分离培养：α溶血：菌落周围的部分红细胞被破坏，呈草绿色溶血环。

β溶血：菌落周围红细胞完全溶解，呈现一个清楚透明溶血环。

与B群抗血清凝集的菌株可直接确认为无乳链球菌。

10.CAMP试验：侮辱链球菌能产生CAMP因子，可促进金黄色葡萄球菌溶血能力，产生显著的协同溶血作用，作为无乳链球菌的初步鉴定实验。

三肠球菌属1.引起肠道外感染（最常见：粪肠球菌）2.致病因素：表面粘附素、炎症调节因子、毒素3.致病类型：泌尿系统感染、心内膜炎、腹膜炎、牙髓疾病4.基本特性：含6.55NaCl肉汤中生长，40%胆汁培养基中分解七叶苷。

10℃、35℃、45℃生长，部分在含有兔血，马血和人血平板上出现β溶血，羊血不出现。

5.生化反应：触酶阴性、胆汁七叶苷、PYR阳性四、奈瑟菌属：1.脑膜炎奈瑟菌：G-，多位于中性粒细胞内，巧克力（色）培养基，主要致病物质是内毒素，是流脑的病原菌。

乙脑（流线性乙型脑炎）和流脑（流行性脑脊髓炎）的区别：乙脑是由乙脑病毒引起的，此种病毒通过蚊虫先在牲（如幼猪、马、牛等）中传播，而后再传播给人。

流脑是脑膜炎双球菌引起的，是由带菌者或病人经呼吸道飞沫传染。

乙脑流行有严格的季节性，大都在夏季和初秋。

流脑流行每于冬末开始，春节盛行，到初夏就明显下降，季节性不如乙脑严格。

两种病发病开始都有发热、头疼、恶心呕吐，典型病人可以有嗜睡、抽搐、昏迷等，但乙脑病人没有菌血症期，不会出现皮肤淤点，也少有很快出现休克者。

重症的病人都会发生颅内压增高的种种危险症状，但乙脑病程进展不象流脑那么迅速。

恢复期常在口、鼻周围起疱疹，而乙脑病程约经2周方进入恢复期，甚至在发病6个月后仍遗留神经、精神方面的症状。