四个不结球白菜自交不亲和S单元型分子鉴定作者：李霞，胡侦华，周国林，等来源：《湖北农业科学》 2015年第16期李霞，胡侦华，周国林，汪爱华（武汉市蔬菜科学研究所武汉蔬菜展示中心，４３６４００）摘要：利用已报道的ＳＲＫ及ＳＬＧ基因序列保守区设计的特异性引物，通过ＰＣＲ扩增和克隆测序，结合生物信息学分析方法对４份国外引进的不结球白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭａｋｉｎｏ）自交不亲和材料的Ｓ单元型进行分子鉴定。
结果表明，不亲和材料Ａ１包含的Ｓ位点基因序列与甘蓝（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａＬ．）ＳＬＧ－３１的相似度为９８％（Ｅ值是０）；不亲和材料Ａ２、Ａ３包含ＣｌａｓｓＩ类及ＣｌａｓｓⅡ类２种Ｓ单元型，Ｓ位点处于杂合状态。
不亲和材料Ａ４包含的Ｓ位点基因序列与青花菜（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａＰｌｅｎｃｋ）单倍型ＢＯＩ１ＳＲＫ蛋白基因具有９８％的序列相似度，序列覆盖度达９９％。
关键词：不结球白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭａｋｉｎｏ）；自交不亲和；Ｓ单元型；分子鉴定中图分类号：Ｓ６３４．３；Ｑ３２１＋．７；Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）１６－３９４８－０４ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．１６．０３０收稿日期：２０１４－１２－１６基金项目：国家大宗蔬菜产业技术体系项目（ＣＡＲＳ－２５－３０）；武汉市规模设施蔬菜关键技术集成与示范项目（２０１３０２１７０２０１１０５８４）作者简介：李霞（１９８１－），女，河南获嘉人，博士，研究方向为小白菜分子育种，（电话）１３２９７０１０３１７（电子信箱）ｌｉｘｉａ＿ｎａｐｕｓ＠１６３．ｃｏｍ；通信作者，汪爱华，女，高级农艺师，博士，从事蔬菜育种学与生物技术研究，（电子信箱）ｗａｎｇａｉｈｕａｌｔ＠１６３．ｃｏｍ。
白菜（ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ．）属十字花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）芸薹属（ＢｒａｓｓｉｃａＬ．），原产于中国，栽培历史悠久。
其规模无论是面积还是产量，在蔬菜作物中均居首位。
不结球白菜，又称小白菜（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ．ｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭａｋｉｎｏ），主要分布在长江流域的中、下游地区，其播种面积约占该地区蔬菜总面积的1/3。
白菜为典型的异花授粉作物，杂种优势显著，利用自交不亲和（Ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）系制种是目前最常用的白菜杂交制种技术之一，其主要靠不同单倍型自交不亲和系之间互配来获得，因此对于育种工作者来说，获得自交不亲和系单倍型的快速准确鉴定至关重要。
目前普遍采用花期交互授粉的方法进行鉴定，其操作过程繁杂、效率低、准确度不高［１］。
快速、准确的鉴定白菜自交不亲和性以及所携带的Ｓ单元型（在遗传上由具有复等位基因的多态性Ｓ位点基因控制的单元类型），不仅可以加速自交亲和系和自交不亲和系的选育进程，而且可以做到有针对性地配制杂交组合、提高育种效率、避免杂交不结实现象发生。
自交不亲和现象是植物在长期进化过程中促进异花授粉、保证物种生存、延续的生殖特性。
根据遗传控制不同，显花植物的自交不亲和特性大致可分成配子体自交不亲和（Ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｉｃｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ＧＳＩ）与孢子体自交不亲和（Ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃｓｅｌｆ-ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ＳＳＩ）２种类型［２］。
配子体自交不亲和是植物界最普遍的一种自交不亲和类型，而孢子体自交不亲和仅存在于十字花科、石竹科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）等植物中。
芸薹属是十字花科孢子体控制型的典型代表，研究表明，芸薹属植物自交不亲和性受单位点（Ｓ－ｌｏｃｕｓ）复等位基因（Ｓ１，Ｓ２，……，Ｓｎ）的控制，在白菜自交不亲和研究中已鉴定出１００多种Ｓ单元型［３，４］。
目前，自交不亲和机理研究认为，自交不亲和现象的发生是花粉与柱头乳突细胞间的自我识别引起的，其识别过程主要体现为Ｓ单倍型特异性的受体－配体识别机制，参与这一识别过程的蛋白主要包括：Ｓ位点糖蛋白基因（Ｓｌｏｃｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ，ＳＬＧ基因）、Ｓ位点受体激酶基因（Ｓｌｏｃｕｓｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ，ＳＲＫ基因）、花粉蛋白外壳基因（Ｓｌｏｃｕｓｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ，ＳＣＲ基因）。
其中ＳＬＧ和ＳＲＫ为柱头表达蛋白基因，ＳＣＲ为花粉壁中存在的特异因子基因，３个紧密连锁的基因参与了花粉和柱头间的相互识别［５－７］。
随着分子生物学技术的不断发展及芸薹属植物自交不亲和性的深入研究，若干Ｓ单元型ＳＬＧ、ＳＲＫ和ＳＣＲ基因序列也已确定。
随着ＤＮＡ测序技术的飞速发展，通过生物信息学分析，白菜自交不亲和Ｓ单元型分子水平的快速鉴定也已成为可能。
试验利用已公布的ＳＲＫ、ＳＬＧ基因特异引物的ＰＣＲ扩增、克隆测序及生物信息学分析等技术，对４份引进的小白菜自交不亲和材料Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４的Ｓ单元型进行分子鉴定，以期为小白菜杂交组合的授粉配制提供参考依据。
１材料与方法１．１材料参试的不结球白菜自交不亲和材料Ａ１，Ａ２，Ａ３及Ａ４都从国外引进，由武汉市蔬菜科学研究所提供。
离心柱型ＰＣＲ产物回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，ｐＭＤ１８－Ｔ载体购于宝生物工程（大连）有限公司。
１．２方法１．２．１ＤＮＡ的提取选取各材料的幼嫩叶片，利用改良的ＣＴＡＢ小样法提取４份试验材料的基因组ＤＮＡ，置于－２０℃环境保存备用。
１．２．２引物设计利用已报道的特异性引物ＰＳ５和ＰＳ１５，该引物是由Ｎｉｓｈｉｏ等［８］设计的用于扩增ＣｌａｓｓⅠ类（Ｓ单元型在花粉中表现为显性）ＳＬＧ的引物，特异引物Ｐ３和Ｐ４是张爱芬［９］设计用于扩增ＣｌａｓｓⅡ类（Ｓ单元型在花粉中表现为隐性）ＳＲＫ基因的引物，引物序列见表１，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
１．２．３ＰＣＲ扩增分别以４份材料的基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ反应体系为２０μＬ。
扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，５２℃退火３０ｓ，７２℃ 延伸９０ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，２５℃保存。
在１．０％琼脂糖凝胶中进行电泳产物检测，紫外凝胶成像系统拍照。
１．２．４目的片段的回收及克隆利用ＰＣＲ产物回收试剂盒对目的片段进行回收，将回收ＤＮＡ片段连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化到感受态大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）上，进行蓝白斑筛选，对阳性克隆进行ＰＣＲ鉴定。
１．２．５测序及序列分析对于鉴定的阳性克隆送样测序，每个样品测定２～３个阳性克隆，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司实施。
序列分析利用ＤＮＡｓｔａｒ软件完成；Ｂｌａｓｔ分析通过ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）在线进行。
２结果与分析２．１Ｓ单元型相关基因的ＰＣＲ扩增利用芸薹属ＣｌａｓｓⅠ类Ｓ单元型ＳＬＧ基因特异性引物组合ＰＳ５＋ＰＳ１５及ＣｌａｓｓⅡ类ＳＲＫ基因特异性引物组合Ｐ３＋Ｐ４对４份自交不亲和材料Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４进行ＰＣＲ扩增，结果见图１。
从图１可见，Ａ１材料只在ＰＳ５＋ＰＳ１５引物组合中有扩增产物，Ａ４只在Ｐ３＋Ｐ４引物组合中有扩增产物，而Ａ２、Ａ３在２对引物扩增条件下都有特异性条带出现。
以上结果表明，Ａ１可能属Ｓ单元型中的ＣｌａｓｓⅠ类，Ａ４则属于ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ单元型。
Ａ２和Ａ３的扩增结果表明在这２份不亲和材料中很有可能包括了２类Ｓ单元型，在Ｓ位点表现为杂合类型。
为了进一步对以上结果进行验证，对上述４份自交不亲和材料中扩增出的目标片段进行回收，并分别连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，进行大肠杆菌转化，挑取阳性克隆进行序列测定。
２．２自交不亲和材料扩增序列的Ｂｌａｓｔ分析将４份自交不亲和材料扩增产物的ＤＮＡ序列测定结果与ＮＣＢＩ已登录的芸薹属核苷酸序列进行Ｂｌａｓｔ比对，以进一步确定它们的Ｓ单元型。
Ｂｌａｓｔ分析表明，自交不亲和材料Ａ１由ＰＳ５＋ＰＳ１５引物所扩增出的１３５６ｂｐ的片段经克隆测序结果比对后发现，其与甘蓝（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａＬ．）ＳＬＧ－３１（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＢ０５４７２９．１）在序列覆盖率为９４％的情况下，相似度为９８％（Ｅ值是０）。
而与白菜Ｓ位点蛋白１基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＨＭ６２９３３８．１）在序列覆盖度为８０％的情况下，与其ＣＤＳ序列相似度达到了９９％（Ｅ值是０）。
以上结果显示，自交不亲和材料Ａ１的Ｓ位点基因序列在较高的序列覆盖度情况下，与甘蓝ＳＬＧ－３１具有较高的相似度；而与白菜蛋白基因１所属的Ｓ单元型在较低的序列覆盖度下序列相似度更高。
因此，要准确鉴定其Ｓ单元型，需要进一步的试验来验证。
自交不亲和材料Ａ２在２对引物扩增条件下都有扩增条带产生，包括１３５６ｂｐ及１０４６ｂｐ２条特异性扩增条带。
对１３９４ｂｐ的序列进行比对后发现，该序列与白菜的Ｓ位点糖蛋白ＳＬＧ－３０基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｄ８５２１７．１）及芜菁（Ｂ．ｒａｐａＬ．ｓｓｐ．ｒａｐｉｆｅｒａＭａｔｚｇ）的Ｓ位点受体激酶基因ＳＲＫ－３０（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＢ０５４６９３．１）的序列具有很高的相似度，分别为９９％和９８％。
因此基本可以确定不亲和材料包含Ｓ３０这一单元型。
对１０５９ｂｐ片段的序列比对后发现，其与芜菁ＳＲＫ－６０、ＳＬＧ－６０基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＢ０９７１１６．１）在覆盖度为９９％的情况下，相似度也高达９９％，远远高于其他单元型，因此可以确定该序列属于Ｓ６０单元型。
所以自交不亲和材料Ａ２基本上可以确定其具备Ｓ３０、Ｓ６０这２种Ｓ单元型，再一次证明自交不亲和材料Ａ２在Ｓ位点为杂合状态。
自交不亲和材料Ａ３也如Ａ２材料，在ＣｌａｓｓⅠ类及ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ单元型引物中都扩增出了对应的目的条带，分别为１３５６ｂｐ及１０４６ｂｐ。
对２条序列的分析结果表明，前者与萝卜（ＲａｐｈａｎｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．）ＳGＴ-６３基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＥＦ０５６４９９．１）在序列覆盖率为９８％的条件下，序列相似度为９９％；后者则与青花菜（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａＰｌｅｎｃｋ）单倍型ＢＯＩ１ＳＲＫ蛋白基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＪＱ２５３７８５．１）具有９８％的序列相似度，序列覆盖度达９９％。
以上结果表明，不亲和材料Ａ３在Ｓ位点也证实为杂合状态。
自交不亲和材料Ａ４属于ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ单元型，对其１０４６ｂｐ片段的序列分析结果（图２）表明，自交不亲和材料Ａ４所包含的ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ位点基因序列与自交不亲和材料Ａ３中的Ｓ位点基因序列一致，２个材料应包含同一类型的Ｓ基因。