电击法转化农杆菌
需要时间:电击操作40min左右+ 培养4h(期间可以干别的事)+ 涂平板操作20min左右+ 培养48h
电转化杯:平时洗净放酒精中;大肠杆菌用2mm;农杆菌用4mm或2mm(4mm好用些)
大肠杆菌:37℃培养24小时(生长较快),1500V/6ms电击
农杆菌:28℃培养48小时(生长较慢),2500V/6ms电击
离心管:1.5mL下端尖2mL下端圆
比例:40μL感受态农杆菌(GV3101) : 1μL质粒
(用手指弹几下混匀)
具体操作过程:
1、将20μL农杆菌和0.5μL质粒混匀,
2、用枪加入4mm电转化杯中,盖上盖,贴标签,
3、在电击器上2500V/6ms进行电击,促使质粒进入农杆菌,
4、电击后,用枪将液体移到装有500μL LB培养液的2mL离心管中,
5、写标签,用石蜡膜封口,
6、在28℃生化培养箱中摇晃培养4h左右,让菌在有氧条件下复苏,
7、将离心管进行离心1min,使菌体沉降到管壁上,
8、准备LB平板,写标签,用酒精擦拭三角玻璃棒,然后在火焰上烧10s左右灭菌,放置冷却备用,
9、用枪吸取100μL 上清液,将剩下液体倒掉,在将枪中液体打入离
心管中,并用枪反复吸打,冲下壁上菌体混匀,(涂平板时100μL 就够了,所以进行离心浓缩)
10、吸出菌液,滴在平板上,用玻棒涂抹均匀,
11、盖上盖,用石蜡膜封口,放入28℃生化培养箱中48h(2天),即可长出菌落。