疟原虫的RDT检测 及镜检技术
丰城市疾病预防控制中心
检验科：黄曾
2014-7-15
疟疾的实验室诊断
1.病原学诊断：显微镜血涂片检查结果阳性；这种镜检确 诊最可靠。 2. 免疫学诊断：（ 1）循环抗原的检测 （ 2 ）循环抗体的 检测 3.分子生物学技术：PCR和DNA探针已应用与疟疾的诊断。 分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟疾 的“金标准” 仍然是病原学诊断显微镜检查疟原虫。
恶性疟成熟裂殖体
• 裂殖子8～32个，通常8～18个， 排列不规则 • 疟色素集中成团块状 • 虫体占红细胞体积的2/3至3/4
薄血膜间日疟雌（大）配子体形态
形状大小：圆形或椭圆形， 较大。 胞浆：深蓝色。 核：一个，较小，深红色， 常偏于一边，核周可见 明显不染色带。 疟色素：黄褐色，均匀散 在，数目较多。
标准的疟疾厚薄血膜位置
各种不同的疟疾血片涂制法：来自标准血片（1人）门诊发热病人血片（1人）
居民普查血片（2人）
血膜的制作
血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写 上受检者的号码，以防差错；待薄 血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上 血片种类的代号和受检者的个人编 号，依次顺序插入标本盒内。
染液的种类
染液种类：疟原虫的染色，目前临床 上应用最广泛的是瑞氏（Wright stain） 和吉氏染液（Giemsa stain）。这些染液 中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝 氧化所成的天青，所以称多色性染剂。
★ 快速诊断试纸条可与镜检 疟原虫相互补充。
疟原虫抗原检测
• （一）原理
• 快速检测试剂是通过在硝酸纤维素膜（NC）试纸条上产 生可见的条带来检测抗原的一种“免疫-层析”试剂。染 色标记抗体与疟原虫抗原结合，复合物由试剂条检测线上 的抗体捕获后，形成一条可见的条带（检测线）。 • 检测的第一步是将溶血剂与血液混合，破坏血红细胞释放 疟原虫蛋白，便于与标记抗体靶蛋白结合；然后将血液与 标记抗体的混合液置于硝酸纤维试纸条上，并通过毛细管 作用和缓冲液/清洗剂推力，使混合液在试纸条上移动并 通过检测线与对照线。
注意事项： 1.高纯度试剂。 2. 所用器皿绝对无水（伊红在水溶液 内遇到美蓝或天青即可互相化合而产 生沉淀，从而失去染色力）。 3. 边加边磨，充分研磨；整个染色液 配制时间不能少于5个小时。
姬氏染液的染色方法
先用甲醇或无水酒精固定薄血膜,再用清水对厚血膜溶脱 血红蛋白，然后再进行染色。 注意：吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色 效果. 成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸， 倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97 毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当 地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将 染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干， 包装，镜检。 单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液1-2滴，加 中性蒸馏水15-30滴，染色30分钟左右，然后用清水轻轻将片 上的染液冲洗干净，晾干镜检。 较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫 的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。
血片制作与染色注意事项
●使用前载玻片一定要清洁，否则会影响 血片制作和镜检结果。 ●厚血膜干燥时勿加热，加热会使原虫变 形，影响镜检结果。 ●配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助 于提高镜检质量。
● 固定薄血膜时勿将甲醇触碰到厚血膜。 ● 冲洗染液时，水流轻缓，勿冲走厚血膜。
血片的镜检
1.在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各 种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。 2.镜检疟原虫，首先学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜 中疟原虫形态后，再学习镜检厚血膜。 3.镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类 时参考和血片编号之用。 4.镜检疟原虫须用油镜头配合5X低倍目镜镜检，当发现 疑难问题时再调换10X目镜进行观察。 5.检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自 左至右（或由右至左），一行接一行，一个视野稍叠 一个视野顺序地查完整个血膜。 一般情况下，厚血膜四周（稍薄些）疟原虫数量较 多，且形态较清楚，镜检时不要忽略。每张厚血膜检 查时间最少不低于20分钟。
薄血膜中常见的血液成分
嗜酸性粒细胞
中 性 粒 细 胞
红细胞 血小板 单核细胞
淋巴细胞
薄血膜疟原虫形态
间日疟 环状体 感染的红细胞：胀大 不明显，基本正常。 虫体大小：较大，约 为红细胞直径1/3。 胞浆：环状，浅蓝色。 核：红色，一个，偶 有二个。 疟色素：无。
约占寄生红细胞的1/3，很少见到一个红细胞 寄生2个环状体和一个环状体有2个核。
标签
标本片
发热病人血片
薄血膜的制作
• 薄血膜 用推片一端边缘的中点从取血部分①取约 1～1.5微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血 滴与平置的载玻片接触，并形成25～350夹角，待血 液向两侧扩展约② 2cm～2.5cm宽时，均匀而迅速 地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。推制时 速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大 小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制 成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之 间互相接触而不相互重叠。③薄血膜外观：舌状厚 薄均匀，无划痕，④位于玻片1/2～1/3处【左半部 分（或第4—6份）】 。
间日疟成熟裂殖 体
红细胞：胀大，褪色，可见 薛氏小点。 大小：个体较大。 胞浆和核：裂殖子12~24个， 通常为16~18个，排列不规 则，核红色，胞浆浅蓝色。 疟色素：黄褐色，常集于疟 原虫的一边。
间日疟裂殖体
恶性疟成熟裂殖体
红细胞：大小正常，颜色 较深，可见茂氏小点。 大小：虫体较小。 胞浆和核：裂殖子8~32 个，通常为8~18个， 排列不规则，核红色， 胞浆蓝色。 色素：黑褐色，集中于中 央或一侧。
我们主要用吉氏染液，它具有方便，染色效 果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色 时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊 量大的门诊实验室使用。
染液的种类及染色原理
注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染液 的pH值7.0-7.2较好。
染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使 红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞和原虫的胞 浆着色较差；反之，当染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细 胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。
恶性疟原虫--环状体
环纤细,约为RBC直径的1/6，RBC不胀大 核1个，但2个常见，红细胞常含2个以上原虫
薄血膜间日疟大滋养体形态
感染的红细胞：胀大褪色， 出现形状大小相等、分 布均匀、数目较多、鲜 红色的薛氏小点。 虫体大小：较大。 胞浆：不规则，浅蓝色， 出现阿米巴伪足，有空 泡。 核： 红色，一个。 疟色素：有，细小杆状， 黄褐色，分布不均匀。
姬氏染液母液配置方法
取姬氏粉 0.5 克置于研钵中，加 25ml 甘油充分研磨，倒入 60 或 100ml带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混 入瓶内，至25ml甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀， 置于55—60℃水浴中或温箱内24h或室温内3—5天，多加摇动，即成原 液。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经 久不变。 材料： 1、姬氏粉0.5克 2、甘油25ml 3、甲醇25ml
熟练工作者的推片姿势
厚血膜的制作
• 厚血膜 用推片的左下角，从取血部位刮取①约 4～5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴 与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋 转，转2～4圈，涂成②直径0.8～1cm大小圆形 厚血膜(厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到 5～10个自细胞为宜)，③厚血膜的位置，位于 玻片右1/3处[中央偏右（或6等份中的与贴标签 的1、2份相邻的第3份中部）] 。④厚血膜外观： 圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄 达不到检出率的要求，以油镜视野5-10个WBC 为宜。
薄血膜疟原虫形态
间日疟 环状体 感染的红细胞：胀大 不明显，基本正常。 虫体大小：较大，约 为红细胞直径1/3。 胞浆：环状，浅蓝色。 核：红色，一个，偶 有二个。 疟色素：无。
薄血膜疟原虫形态
恶性疟环状体
感染的红细胞：大小正常,颜 色较深。 虫体大小：较小，约为红细 胞直径1/5-1/6。 胞浆：蓝色，环状纤细,有时 位于红细胞的边缘。常见 多个原虫同寄生于一红细 胞的现象。 核：红色一个,常有二个。 疟色素：无。
血膜的制作（取血操作）
在采集标本、制作血片前，首先要核 对患者的姓名、年龄和住址。 • 采血部位和方法：采血部位一般人为耳 垂，指头；一人一针，常规消毒、采血。
取血部位和血量
采血部位和取血方法：
耳垂或无名指（婴幼儿母 趾或足跟），通常在耳垂 取血，先用75%酒精棉球消 毒取血部位，待酒精干后， 用左手拇指和食指紧捏耳 垂上方或无名指指尖，右 手持消毒针迅速刺入皮肤， 不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻挤压出血。 厚血膜血量约一粒大米 （即火柴头）大小。
间 日 疟 大 滋 养 体
虫体不规则，较大； 阿米巴样空泡明显； 疟色素细小，黄褐色。
间日疟大滋养体
恶性疟大滋养体
受感染红细胞：大小正常， 颜色较深，可出现较粗、 大小不一、分布不匀、 数目较少红色茂氏小点。 虫体大小：较小。 胞浆：蓝色，圆形，坚实， 体积小。 核：一个，红色。 疟色素：较细的黑褐色颗 粒，常集成块。
恶性疟大滋养体
间日疟未成熟裂殖体
红细胞：胀大，褪色， 可有薛氏小点。 胞浆：较不规则，空泡 小或消失，浅蓝色。 核： 红色，分裂为二个 以上。 色素：黄褐色，分布不 均匀。
薄血膜疟原虫形态
间 日 疟 未 成 熟 裂 殖 体
恶性疟未成熟裂殖体
红细胞：大小正常，颜色较 深，可有茂氏小点。 大小： 较小。 胞浆：规则，圆形或卵圆形， 蓝色。 核：分裂为二个以上，红色。 色素：黄褐色颗粒，常集成 黑褐色团块。