基本原理：是通过稀释使菌体细胞充分 分散，单细胞得以生长发育形成菌落， 可使用稀释法或平板划线法进一步纯化， 还可通过平板菌落计数，推算单位重量 土壤样品含有微生物的数量。
实验步骤：

1、采样一般定点于耕作层0--20cm，先除 去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混 匀后用无菌塑料袋分装。
2. 培养基的制备与分装
（1）三角瓶固体培养基的制备 1.称量按培养基配方比例依次准确地称取药 品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） 2. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 3.完全溶解后，补充水分，调pH值（不要调 过头） 4.分装置三角瓶中，注意装液量 5. 加棉塞，包扎，高压蒸汽灭 菌,121℃,0.10Mpa,20min
1、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 3.0g、蛋白胨 10g、 NaCl 5.0g、水1000ml、 PH7.4-7.6 2、高氏1号培养基（放线菌） 可溶性淀粉 20g 、 NaCl 0.5g、琼脂 15-20g、 FeSO4·7H20 0.01g、MgSO4·7H20 0.5g 、 KNO3 1g 、 K2PO4·3H20 0.5g、水 1000ml、 PH7.47.6 3、马丁氏培养基（真菌） KH2PO4 1g、 MgSO4·7H20 0.5g 、蛋白胨 5g、葡 萄糖 10g、琼脂 15-20g、水 1000ml、 PH
（2）试管斜面固体培养基的制备

a.称量按培养基配方比例依次准确地称取药 品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） b. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 c.完全溶解后，补充水分，调pH值 d.在培养基未融化之前，用10mL移液管快 速加入试管内，每根7-8mL，塞上棉塞，包 扎，灭菌，灭菌完后摆斜面。
干燥箱
细菌过滤器
用于滤过除菌的各式滤器
手提式灭菌锅
坐 式 灭 菌 锅
卧式灭菌锅
高压蒸汽灭菌器
三、实验器材
1、试剂：牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、 NaCl、PH试纸、琼脂、葡萄糖、孟加拉红、 FeSO4· 7H20、MgSO4· 7H20、 KNO3、 K2PO3· 3H20 2.仪器及其它
吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉 花，用长纸条包扎、打结。 玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。 三角瓶的包扎
1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备
（1）计算 （2）称量 准确称取各种成分。 （3）溶解 向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用 水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍 放冷。 （4）调pH值 用酸度计或精密pH试纸测定其pH值， 并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱 脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压 蒸汽灭菌后，pH常降低。 （5）分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装 入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图1-1） （6）包扎 试管扎成捆。 （7）灭菌 高压蒸汽灭菌15~20min。
2、制备土样稀释液 吹吸几次混匀 另留一管不稀释留作对照（CK）

无菌操作
倾注法接种

先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接 入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每 个平皿倾注约15 ml的牛肉膏蛋白胨培养基 （48℃）待冷凝，混合均匀。
分区划线法纯化
计数

要求30~300之间计数。CK除外 每克湿土样细菌数量 ＝平均菌落数×稀释倍数 土壤样品水分系数 ＝1∕（1–样品水分百分数） 土壤样品细菌数量（个∕克干土） ＝每克湿土样细菌数量×样品水分系数
1、满足微生物生长培养所需的营养要素： 碳源、氮源、无机盐、维生素、生长因子等 2、合适PH值 3、抑制其它微生物生长的物质。
分类
主要用于增菌 用于检测动力及保存菌种 用于分离鉴定细菌
分类
普通琼脂培养基 血液琼脂培养基 三糖铁培养基 SS培养基 庖肉培养基
培养基的制备程序
1、调配 过滤 矫正pH（7.0-7.6） 分装过滤 灭菌（121.3℃，2030分钟） 鉴定是否有菌 放入冰 箱冷藏备用 2、因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫 正pH时应比所需的pH高 3、鉴定是否有菌可将培养基置于37 ℃培养24 小时，然后观察
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天ห้องสมุดไป่ตู้、药匙、高压蒸 汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻 绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻 璃珠
四、实验方法和步骤
1、微生物常用玻璃仪器的包扎和棉塞的制作 培养皿的包装每10套一包，用旧报纸包扎 （或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。
思考题



1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检 查灭菌后的培养菌是无菌的？ 2.加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表 上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温 度？为什么？ 3. 土壤微生物分离要注意什么问题？ 4.管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉 皮塞代替？为什么？
3.培养基、无菌水、器皿的灭菌



1.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内， 湿热灭菌。 2.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。 3.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。
二、土壤微生物的分离、纯化

土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同 类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物 通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量 测定。
实验一、微生物的分离与纯化
一、培养基的制备与灭菌
1.牛肉膏蛋白胨培养基（细菌） 2.高氏1号培养基（放线菌） 3.马丁氏培养基（真菌）
二、土壤微生物的分离、纯化
实验目的


1、熟悉培养基制作原理； 2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培 养基的一般方法和步骤； 3、了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具 体操作方法； 4、了解土壤微生物的分离纯化的基本原理； 5、学习并掌握微生物分离纯化技术方法。
一、培养基的制备与灭菌

培养基是人工配制的微生物生活环境， 其主要用途是繁殖及分离接种微生物， 传代或保存微生物，鉴别微生物的类属， 研究微生物的生理及生化特性，制造菌 苗、疫苗或其他微生物制剂等。其营养 成分包括微生物生长所需要的水分、碳 源、氮源、无机盐及某些生长因子（维 生素、辅酶）等。
二、实验原理