膜片钳技术在神经元电信号测试中的进展葛曼玲 赵全明 郭鸿涌 颜威利(河北工业大学生物电磁技术研究一室 天津 300130)摘要 介绍了近年来膜片钳在神经元膜离子通道电信号和信号转导测试中的应用,给出了它在神经元及相连神经元实验中的进展情况,分析了其在神经细胞和分子生物学研究领域上的发展前景。
关键词 膜片钳 脑片膜片钳 神经元 测试The Present Patch-clamp Technique in Neuron Electrical Signal TestGe M anling Zhao Quanming Guo Hongy ong Yan Weili (N o.1B iomedical Electromag netic Resear ch L abor atory,H ebei U niv er sity of T echnology,T ianj in300130,China)Abstract T he art icle mainly int roduces the pat ch-clamp technique and its applications in the electrical signal test of ion channels on t he neuron membrane and the signal t ransduct ion in recent years,gives its experimental im-provement f or t he neuron and netw ork,it also analyzes the f ut ure in the neuron cell and molecular biology.Key words Pat ch-clamp Pat ch-clamp recording in brain slices N euron T est1 引 言神经元电信号测试是神经科学实验的关键技术,它集细胞和分子生物学、电子测量技术、信号处理及转化技术于一体,成为生命科学研究的重要手段,在提供生命的信息和揭示生命的奥秘、解决困扰人类的疾病等方面具有重要的应用价值。
生物电信号测试开始于神经细胞,先后经历了三次关键的发展阶段:细胞内记录、电压钳技术、膜片钳技术。
膜片钳由N eher和Sakmann于1976年创立,首次成功完成了在细胞膜上实现单离子通道电流的记录,并可同时完成膜片电位的钳制、监测及测定,大大克服了电压钳技术的局限性。
这项技术的主要改进是在电极上:其电极端和膜之间形成10～100G 高阻,较电压钳提高了两个数量级,选用的运算放大器增益和输入电阻以及主要由连接于电极内侧的电流-电压转换器组成的测试电路灵敏度和精度更高,更集成化,已成为现代电生理研究应用最广泛的实验手段。
2 膜片钳在神经元和网络电信号测试中的进展 对神经元膜离子通道的电测量常以动作电位、静息电位、离子电流等参量的测试居多。
膜片钳放大器内可采用电流钳制模式和电压钳制模式两种,不同电参量,可采用不同的形式。
膜片钳是单离子通道跨膜电流测量主要测试手段。
神经元内电信号以及神经元间信号转导经常以神经元膜电特性变化为结果,其变化形式与神经元种类有关,不同的离子通道介导不同的电信号:例如,在肌肉细胞上有产生动态电信号的离子通道,在感觉器官有将诸如光、机械、电、磁等物理刺激或药物等化学刺激转化成电信号的离子通道,既使在没有连接于中枢神经系统内的细胞中,象处于血液、免疫系统中的细胞也存在能实现电信号与其它各种信号互相转导的离子通道[1],因为它涉及到许多学科的交叉,神经元的这些调制作用成为现代生物医学工程的研究热点。
近年来,高科技应用到膜片钳的测试中,大大提高第23卷第3期增刊 仪 器 仪 表 学 报 2002年6月 天津市自然科学基金资助项目。
了对单离子通道电信号测试实验的广度、深度和精确度,对其它细胞电信号测试也为神经元信号的研究提供了很好的借鉴。
例如,应用荧光显微镜结合膜片钳实现对单细胞膜的动作电位、跨膜电流等电特性的测量[2],膜片钳技术与基因克隆技术结合的例子也不少[3],这是因为为克隆的通道蛋白制备通道探针后,分析其跨膜孔道形成、离子选择性等内容要由膜片钳完成。
光学成像结合膜片钳为神经元电生理的测试提供了有力的手段。
神经元膜电容的测量是研究神经递质胞吐动力学和神经元动作电位时程的主要工具。
使用全细胞记录可直接检测到一个囊泡胞吐过程膜电容和跨膜电流的细微变化,从而为细胞信号通讯提供一定的实验依据。
在最近,G ent et等人又对神经元电容的测试提出了一种简洁的膜片钳实验手段[4]。
在神经元网络系统中,信息依赖突触实现电信号之间或化学信号与电信号之间的转换。
应用膜片钳实现突触电特性测量成为神经元网络实验研究的重要方面[5],这些实验将为神经元网络非线性和与突触有关的神经疾病研究提供很好依据。
神经元网络的研究离不开Ca2+离子,它不仅是细胞信号转导研究的重要内容,而且也是神经元自发放电和混沌等非线性研究的热点[6]。
应用膜片钳对细胞内Ca2+离子的实验研究通常要借助mag-f ura-2-A M和ae-quorin等荧光显影剂的帮助,目前主要在对神经元膜电压依赖Ca2+通道、Ca2+敏感K+通道、IP3受体Ca2+释放通道(与内质网Ca2+库有关)等方面的研究上[7,8]。
膜片钳技术本身也在不断地改进。
它除了具有四种基本模式外,现在,已发展为多种形式以适应各种信号测试的要求,例如,可利用聚烯抗生素代替负压的方法实现膜片钳电压钳制模式,这种方法也称为穿孔膜片技术,应用在通道电流强度和变化速率较小的场合,其性能要优于全细胞记录模式。
特别值得一提的是在20世纪90年代出现的膜片钳和脑片技术相结合的脑片膜片钳技术(patch clamp recording in brain slices),它可在不破坏神经细胞天然联系的状态下测定神经元离子通道的电活动,克服了膜片钳只记录单细胞的局限性,很适宜神经元网络电生理特性研究。
最早,O slo 大学的Anderson Per和K yot o大学的T akahashi T o-mo在这方面做了大量的工作[9],现在,使用此技术研究神经细胞的文章在诸如Neuroscience、Brain Re-search等世界著名杂志上经常出现。
将膜片钳应用于爪蟾卵母细胞也是当前研究的一个重要方面[10],使用膜片钳对爪蟾卵母细胞表达的外源性离子通道活动的检测是较容易的,而对该种细胞宏膜电流的测量则要借助于双微电极的电压钳技术[11]。
3 结 论膜片钳不仅是神经元膜电信号测试的重要实验手段,同时也为神经计算科学和脑的高级功能的研究提供了重要的依据[12]。
在当今,诸如神经元节律及其网络非线性研究、同步振荡、神经元编码与通讯等现代神经科学研究领域都要以对它的相关实验数据作为基础,在分子生物学的角度上研究脑疾病的产生机制和治疗[13]也离不开膜片钳及脑片膜片钳技术,随着神经科学研究深入,膜片钳将不断与新技术融合,从而促进现代生命科学的发展。
参考文献1 N eher E.,Sakmann B..T he patch cla mp tech-nique.Scientific A mer ican,1992,M arch:44～51.2 Ry ttsen F.,F arr e C.,et al..Character ization o f sing le-cell electr opor atio n by using patch-clamp and fluor es-cence micr oscopy.Bio phy sical Jour nal,2000,O ct,79: 1993～2001.3 Stro mberg A.,et al..M anipulating the g enetic ident ity and bio chemical sur face pro per ties of individual cells with electr ic-field-induced fusion.Pr oc.N atl.A cad.Sci.U SA.,2000,97:7～11.4 G entet L.J.,Stuar t G.J.,Clements J.D..D ir ect mea-surement of specific membr ane capacitance in neuro ns.Bio phy sical Jour nal,2000,July,79:314～320.5 V eenstra R.D..V o ltag e clamp limitation of dual who le-cell g ap junction curr ent and v oltage r ecor dings.I.co n-duction measurem ents.Biophysical Journal,2001,M ay,80.2231～2247.6 Chay T.R.,Fa n Y.S.,L ee Y.S..Bur sting,spiking, chaos,fr actals and univer sality in bio log ical r hythms.Int.J.Bifur catio n and Chaos,1995,5(3):595～635.7 Lev itan I.B..M odulation o f io n channels by pr o sphor y-lation and depho spho ry lation.A nnu.Rev.Phy siol., 1994,56:193～212.8 Chay T.R..Electr ical bursting and luminal calcium o s-cillat ion in ex cit able cell m odels.Bio l.Cybern.,1996, 75:419～431.9 Edwa rds F.A.,K onner th A.,T akahashi T..A thin slice pr epar ation fo r patch clamp r eco rding s fr om neu-r ons of the mamm alian centr al ner vo us system.Pfluger(下转第76页)71 第3期增刊膜片钳技术在神经元电信号测试中的进展为增加的点属高位点,趋势为减小的点属低位点。
对比同样频率的数据点,沿第二主成分方向也有增加和减少两种走势,分别对应着高位和低位。