大蜡螟幼虫被昆虫病原线虫Heterorhabditis beicherriana n.sp.侵染后体内四种酶活性的变化摘要：为了解新种昆虫病原线虫Heterorhabditis beicherriana n.sp.侵染昆虫的作用机制及昆虫对这种线虫侵染的应激反应，本文研究了大蜡螟幼虫被这种昆虫病原线虫侵染后体内的酪氨酸酶（TYR）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活性的变化情况。

实验结果表明：H.beicherriana 对大蜡螟幼虫的侵染在短时间内（0-40h）就能诱导其体内这四种酶活性发生显著变化，其中TYR和AChE的活性随侵染时间的增加而呈上升态势；而CarE和GSTs 的活性随侵染时间的增加而呈不同程度的波动，但在侵染40h时，其活性均大于0h的值。

另外，在20-80IJS/蜡螟剂量范围内，这四种酶的活性随线虫剂量的增大而增大，其活性大小顺序均为：80/IJS蜡螟>40/IJS蜡螟>20/IJS蜡螟。

大蜡螟幼虫体内这四种酶的活性因线虫侵染而增大，这就增强了其对侵入体内的线虫、共生菌及其分泌的具有杀虫活性物质的解毒能力或抵抗力。

INTRODUCTION昆虫病原线虫或其共生菌能产生一些具有杀虫活性的物质，如毒素toxin、毒素蛋白toxin protein、蛋白酶protease等，这些物质有助于线虫对寄主昆虫的侵染(AAAAA; Toubarro, 2009)。

这些具有杀虫活性的物质常会引起昆虫一些酶活性发生变化。

斯氏线虫S.carpocapsae的分泌物中含有的蛋白酶能抑制酪氨酸酶的活性(Balasubramanian, AAAAA; 2010)。

昆虫病原线虫共生菌嗜线虫致病杆菌产生的具杀虫活性的蛋白Tp40能诱导昆虫体内羧酸酯酶酶活性的增加（杨君，2008）；也能产生单萜化合物Benzylideneacetone来抑制磷脂酶A2的活性，从而一定程度地调控小菜蛾的免疫反应（Kim, 2011）。

昆虫被昆虫病原线虫侵染后体内一些酶活性也会发生变化，大蜡螟幼虫被异小杆线虫H. zealandica侵染后α-糖苷酶的活性高于对照的活性（Zółtowska（2004））；而被斯氏线虫S. affinis和S. feltiae侵染后体内海藻糖酶的活性也高于对照的活性（Zółtowska AAAAA, 2006）。

当大蜡螟幼虫被斯氏线虫S.affinis和S. feltiae侵染一天后，体内SOD活性显著下降(Zółtowska, 2006)；菜青虫（姬国红（2009））和黄粉虫（张芸（2010））被夜蛾斯氏线虫侵染后SOD、POD和CAT的活力总的变化趋势是先显著上升，再显著下降。

因此，可以认为昆虫病原线虫侵染昆虫后引起其体内酶活性的变化是昆虫病原线虫侵染机制的重要组成部分，也是昆虫对线虫侵染的应激反应的重要组成部分。

酪氨酸酶（tyrosinase, TYR）是昆虫体内一种重要酶类，能氧化昆虫体内的酚类物质产生黑色素，黑色素可以包被和黑化侵入的不能被细胞吞噬的大型外来物，包括病原微生物，以抑制病原物的生长和繁殖，减轻对寄主细胞的为害；黑化过程中形成的醌有很高的毒性，可以杀死侵入的微生物和被感染的细胞，阻止其扩散(Sugumaran, 2000)。

因此，酪氨酸酶常被用作评价昆虫免疫系统强弱的一个重要指标(Cai, 2001)。

乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是影响有毒物质对昆虫产生毒性作用的重要因子，其敏感度的降低是造成许多昆虫对一些有毒物质如有机磷酸酯类杀虫药剂敏感度降低的原因（AAAAA Fournier, 1994）。

羧酸酯酶（carboxylesterase, CarE）和谷胱甘肽-S转移酶(gultathione S transferases，GSTs)是昆虫体内重要的解毒代谢酶，参与各种外源毒物的代谢，而外源毒物对这两种酶活性的影响会造成昆虫代谢紊乱而影响其正常的生理生化过程（唐振华，1993）。

因此，研究昆虫被昆虫病原线虫侵染后体内TYR、AChE、CarE和GSTs活性的变化对于阐明昆虫病原线虫的侵染机制和昆虫对昆虫病原线虫侵染的应激反应有重要意义。

昆虫病原线虫Heterorhabditis beicherriana n.sp.（以下简称H.beicherriana）是本实验室发现的新的异小杆线虫品种，对大蜡螟幼虫具有很好的侵染致死作用，大蜡螟幼虫被H.beicherriana（剂量为20、40和80IJs/蜡螟）侵染40h-48h时死亡率就达35%-60%（此部分实验另文发表）。

为了在未来能更好地将其应用于农业生产中，有必要对其侵染害虫的机制和昆虫对其侵染的应激反应进行研究。

本文用大蜡螟幼虫作为标准试虫，研究了H.beicherriana对其侵染后，其体内TYR、AChE、CarE和GSTs活性的变化，以期为更好地应用H.beicherriana防治害虫提供更多的理论依据。

MATERIALS AND METHODSInsects and EPNs大蜡螟（G.mellonella）末龄幼虫，体重为0.18-0.20 g/条，在人工气候箱内用人工饲料连续饲养超过60代。

饲养条件：温度为28℃，相对湿度68%。

昆虫病原线虫H. beicherriana，2010年4月采自AAAAA樱桃园樱桃树根际的土壤中，然后分离、纯化，用大蜡螟末龄幼虫扩繁，感染期线虫（IJS）储存于4℃冰箱内。

Insects infected by EPNs在 1.5ml塑料离心管盖上钻个小洞，以便于大蜡螟幼虫放入离心管后能自由呼吸。

然后将滤纸适当剪裁后卷起放进离心管中，滤纸紧贴离心管内壁，使离心管中有足够空间容纳一头大蜡螟幼虫。

将侵染期H.beicherriana线虫的悬浮液按3种剂量（20、40和80IJs/蜡螟）用移液器加到离心管内的滤纸上，并且让线虫悬浮液均匀分布于滤纸上。

再以等体积的蒸馏水均匀加到离心管内的滤纸上，作为对照处理（即0IJs/蜡螟的剂量）。

最后在每个离心管中放入一条大蜡螟幼虫，盖紧离心管的盖，放在人工气候箱（温度28℃，相对湿度68%）内静置。

每8 h取一次样，将用各剂量H.beicherriana线虫处理过的大蜡螟幼虫取出放-20℃冰箱贮存备用，最后一次取样时间为处理大蜡螟幼虫后40h。

-20℃冰箱中贮存的大蜡螟幼虫在一周内用于实验。

大蜡螟末龄幼虫常吐丝结茧并进入相对静止的状态，特别是处于离心管等封闭的环境时。

为了不影响线虫对其进行侵染，在每次取样后，把继续处于离心管内的大蜡螟幼虫吐丝结成的茧或网用镊子破坏掉。

Enzyme preparation将玻璃匀浆器于冰水混合物中预冷，然后加入10 头大蜡螟幼虫和40ml磷酸缓冲液（0.05mol/L、pH7.0），在冰浴条件下充分研磨；再用40ml磷酸缓冲液稀释匀浆液，混匀后在4℃、10000×g条件下离心30min，取上清液备用。

Protein content of enzyme solution was measured according to the method of Bradford (1976).Statistical analysisExperiment was repeated for three times. Statistical analysis of data was performed with SPSS 13. Data analysis of variance (ANOVA) was performed by using Duncan’s multiple range test s at a significance level of 0.05.RESULTS大蜡螟幼虫被H.beicherriana侵染后体内酪氨酸酶活性的变化三个H.beicherriana侵染处理（20/IJS蜡螟、40/IJS蜡螟、80/IJS蜡螟）的大蜡螟幼虫体内TYR的活性在8h时与0h时相比显著上升，16h时又显著下降。

在这两个时间段里，对照处理的大蜡螟幼虫（0/IJS蜡螟）体内TYR的活性的变化趋势与三个H.beicherriana侵染处理的情况相反。

在随后的时间段里，三个H.beicherriana侵染处理的大蜡螟幼虫体内TYR的活性不断地显著上升，在40h时，TYR的活性达到最大，且均大于对照处理的值。

对照处理的大蜡螟幼虫在40h时体内TYR的活性也显著大于0h时的值。

四个处理（0, 20, 40, 80/IJS蜡螟）在40h时TYR的活性分别是0h 时活性的2.24, 6.57, 7.94, 8.12倍。

因此0-40h的时间段里，四个处理的大蜡螟体内TYR的活性随线虫侵染时间的增加而呈上升态势。

另外，三个H.beicherriana侵染处理的大蜡螟幼虫体内TYR活性的变化具有较明显的剂量效应，其活性大小顺序为：80/IJS蜡螟>40/IJS蜡螟>20/IJS蜡螟（Fig.1）。

Fig.1大蜡螟幼虫被H.beicherriana侵染后体内乙酰胆碱酯酶活性的变化对照处理的大蜡螟幼虫体内AChE的活性在8h时与0h时相比显著下降，随后AChE的活性上升，到24h时活性显著高于此前三个时间点的值；在24-40h里，AChE的活性显著下降。

在0-16h的时间段里，三个H.beicherriana侵染处理的大蜡螟幼虫体内AChE的活性均是先升后降，但20/IJS蜡螟处理的AChE的活性变化不显著，40/IJS蜡螟、80/IJS蜡螟处理的AChE的活性在8h时显著大于0h时。

在16-32h的时间段里，三个H.beicherriana侵染处理的大蜡螟幼虫体内AChE活性不断显著上升；32h和40h时，三个H.beicherriana侵染处理的大蜡螟幼虫体内AChE活性差异不显著。

在40h时，三个H.beicherriana侵染处理的大蜡螟幼虫体内AChE活性均显著大于0h时的值，因此在0-40h的时间段里，三个线虫处理的大蜡螟幼虫体内AChE的活性随线虫侵染时间的增加而呈上升态势。

另外，三个H.beicherriana侵染处理的大蜡螟幼虫体内AChE活性的变化具有较明显的剂量效应，其活性大小顺序为：80/IJS蜡螟>40/IJS蜡螟>20/IJS蜡螟，并且各时间点的AChE的活性均大于对照的值（Fig.2）。

Fig.2大蜡螟幼虫被H.beicherriana侵染后体内CarE活性的变化对照处理的大蜡螟幼虫体内CarE的活性在0h至24h的变化趋势是先降后升，24h时CarE的活性显著大于0h时的值；随后CarE的活性下降，到40h时活性显著小24h时和32h时的值。