2022/3/23
幻灯片制作：WSY18
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柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积
每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间
增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积
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柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091208.D)
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07090605.D)
2.275 253.288
Area:
2.450 3.471
3.008 4.084
40
50 40
35
30
TF=1.31
30
同一厂家相同硅胶基质的反相柱：
• 保留值随含碳量的增加而增加
• 比表面积越大，保留值越大 • 键合碳链越长，保留越大
C18 ≈ C8>C3>C1，长链之间差别不大
固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
硅胶双层表面修饰后
• 新增加表面层硅羟基活性更低－新硅羟基pH=5.2， 普通硅
羟基pH约为3.5 更对称的峰型，提高柱效，提高灵敏度
• 硅胶表面更均匀－硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖
重现性更好
• 表面纯度更高－硅胶金属杂质被覆盖
极性化合物保留和分离更好
色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）
；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混
合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检 测器（流通池）
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分离度
杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱
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柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II
硅胶纯度－金属含量
d
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固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响
残余硅羟基的影响
普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟 基会带负电荷，碱性化合物拖尾。
合类型；流动相，温度 灵敏度《 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 稳定性和重现性《 基质表面特性，键合类型；流动相，温
度
流动相 《 pH，缓冲盐种类，溶剂；
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影响色谱柱性能的主要因素
1、 色谱柱的构型 • 色谱柱内径 • 色谱柱长度
2、 固定相柱填料 • 粒径 • 比表面积 • 孔径 • 孔隙率 • 基质表面特性： - 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 • 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性
AUMI Baulo StableBond C18, 2.1×50mm, 5µm
Brand A C18 2.1×50mm, 5µm
Phenomenex Luna C18, 2.0×50mm, 5µm
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双层表面修饰
代表产品：
StableBond C18， PolarBond C18， SurfBond C18
多孔材料的95%以上表面 在孔内部
样品分子直径小于平均孔 径，才能进入微粒内部
孔径至少是样品流体学直 径的4倍
300Ǻ孔径用于：超过50个 氨基酸的肽或25个残基的低 聚寡核苷酸
样品分子直径小于平均孔径， 才能进入微粒内部
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柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II
硅胶纯度－金属含量
OH OH
OH
2.3-二羟基萘
HO
2.7-二羟基萘
Venusil MP C18 5μm, 4.6mm×150mm Brand H, C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
Brand W, AQ Column 5μm, 4.6mm×150mm
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091702.D)
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键性化合物峰形对比
C18 (non-endcapped, twin-layer
Brand A C18( nonendcapped, )
Test conditions: Column dimension: 4.6 mm x 150mm Sample: doxepin, nortriptyline, trimipramine amitriptyline Mobile phase: Acetonitrile/0.01M sodium phosphate (pH=6) = 70/30 Temperature: 30 oC Flow: 1 mL/min Detection: UV 254 nm
0
2
4
6
8
10
min
流动相： 甲醇：水=65：35
流速：
1 mL/min
温度：
35℃
检测波长： 230 nm
进样量： 20 μL
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硅胶基质类型及发展史
Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量， 高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附
Type B：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅 烷）水解/烧结/酸洗
TF=1.42
40
25
30
20
20
20
15
10
10
10
A2r.ea8:84900.399
TF=1.39
5
0
0 0
0
1
2
3
4
5
6
7
min
0
1
2
3
4
5
6
7
min
0
1
2
3
4
5
6
min
Brand Z,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
mAU
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091202.D)
O CH3 Si O CH3 O CH3
Hydrolysis
OH
Si O Si O Si O Si (CH3)2Si-R
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si (CH3)2Si-R
OOO
OH
Si O Si O Si O H
OOO
OH
Si O Si O Si O Si (CH3)2Si-R OH
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Saponins Extract
Zorbax SB C18
ASB C18
4.6x150 mm column, 1% formic acid/MeOH= 80/20
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固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
0.01 ng/mL Pseudoephedrine
解决方法
封尾 双层表面修饰 表面杂化
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固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
封尾
键合填料与小硅烷进行后续反应，如三 甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，
以增加表面覆盖率。
缺点：
不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被 反应） 在pH<3时，TMS易流失，耐用性，稳定 性不好
灵敏度
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色谱柱类型、选择和方法开发
2022/3/23
幻灯片制作：WSY18
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色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响
分离度《 - 选择性 〈 键合类型，基质表面特性；流动相、温度 - 柱效 〈 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速
峰对称性《 基质表面特性，键合类型，流动相，温度 保留体积《 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键
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11Leabharlann 色谱柱的构型对色谱柱性能的影响
2022/3/23
幻灯片制作：WSY18
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色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径
色谱柱尺寸 对色谱分离的影响：
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 • 窄径柱 ( 2.1mm) – 满足检测器和样品量限制 • 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命
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TMS
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固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响
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固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响
双层表面修饰
降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀
Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H OOO Si O Si O Si O H
Brand U,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm