①பைடு நூலகம்
分
②
化
芽、芽丛
切割芽丛 继代培养 试管苗
大量芽丛
愈伤组织培养
已分化细胞
脱分化
具分裂能力的细胞 分 裂
诱导期
分裂期
愈伤组织
继 代
愈伤组织
分化期
愈伤组织诱导
◆ 双子叶植物>单子叶植物和裸子植物
◆ 幼年细胞和组织>成年细胞和组织 ◆ 二倍体细胞>单倍体细胞 ◆ 根据培养目的选取外植体
愈伤组织诱导
◆ 外植体大小一般为0.5cm的圆柱形或
④生根困难的则在培养基中搭滤纸桥或按①
⑤其它方法
生根其它方法
◇延长在增殖培养时间
◇降低增殖倍率，减少CTK用量 ◇对易生根植物，切割粗壮嫩枝在营养钵中 直接生根
◇胚状体发育成小苗不经生根阶段，但需 壮苗生根
（4）培养条件 接种只是完成了离体培养的第一 步，植物离体培养和栽培植物一样， 生长过程中也受到各种环境因素的 影响。培养条件是离体培养能否成 功的关键。在培养基条件适宜的基 础上，影响试管苗生长的主要因素 有光照、温度、湿度、氧气。
自 然 环 境 生 长 植 株
温室控制条件下生长植株
已离体培养植株
在多数情况下，应尽量使用温室或 人工气候室控制培养的植物材料作为 外植体来源，减少培养过程中的微生 物感染概率。同时，生长在控制条件 下的植物可以保持培养材料间的一致 性，提高实验的可重复性，也便于培 养技术的规范。
某些多年生植物或特殊材料，必须取 自自然生长的植物，就需要尽可能避免 使用那些生长过于潮湿和不洁净环境中 的植物。对于培养过程中可能出现内生 菌污染的材料，应尽量取生长旺盛期的 生长点部位作为起始培养的材料。
一般来说，无论何种类型的细胞组 织培养技术，起始阶段均涉及外植体取 材、灭菌与接种培养等基本过程。
外植体来源的环境以及外植体的类型 ，均会影响将来培养的效果，而灭菌、 接种和培养条件的选择与控制，也与外 植体的来源和类型有关。
1、外植体的来源
-生长在自然环境下的植物 -有目的地培育在温室控制条件下生长的 植物 -无菌环境下已经过离体培养的植物 自然环境中生长的植株，一般带有微生 物，甚至与某些微生物具有寄生关系，使植 株具有内生菌。取自这些植物的外植体，在 培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养 效果。
第三章 植物组培快繁程序
植物快速繁殖就 是应用组织培养技术, 快速繁殖名优特新品 物，使其在较短时间 内繁衍较多的植株。 快繁是当前植物细胞 组织培养中应用最广 泛，又最有效的方法 之一。
主要内容
一、供体植株的培养与取材 二、外植体的灭菌与接种 三、培养
四、驯化移栽
五、组培快繁计划安排与实施
一、供体植株的培养与取材
根茎型
微枝扦插型
丛生芽增殖型Ⅰ
顶芽
腋芽
丛生芽增殖型Ⅱ
顶 芽
初 代
微型扦插
侧 芽
带芽的 茎切段
CTK刺激 接种培养
形成的茎梢节长， 直立向上呈小灌木 丛状
无愈伤组织产生 继 代
茎段培养 继代扩繁 生根培养
试管苗
获得较多嫩茎梢
器官发生型Ⅰ
器官发生型Ⅱ
外 植 体 初 代 继 代
生根培养 脱分化 愈伤组织
②白光促进小花天竺葵愈伤组织 的生长，蓝光则无作用。
3）光照时间
根据植物生物学特性决定； 光照长短对试管内花的形成是个重要影响因 素，一般给予周期性光照比较好。多数植物 8-10小时黑暗为宜。光周期长短因植物种类 而异。在胡萝卜组织培养中随着日照长度的 增加，而促进生长。
温度
1）大多数植物23-32℃，一 般控制在25±2º C。低于 15C或高于35C，对生长 都是不利的。 2）植株种类及外植体的不 同，其最适温度也是不同 的。如百合20℃；月季25 －27℃；番茄28℃。
pH值
1）培养基适宜pH值5-6.5，一般为5.8， 调整用0.1M的NaOH和HCl溶液 。
2）ｐH影响培养基的硬度。 ｐH ＞6.5 培养基会变硬； ｐH ＜5.0 培养基不易凝固。 3）灭菌之前，培养基的pH要比标准提高 0.2－0.3个单位。
气体(必要条件)
1）培养瓶内氧气 的充足与否与封口 材料有关。 可用棉塞或特制的 封口塑料。通气最 好的是棉塞，但棉 塞易使培养基干燥， 夏季易引起污染。
（3）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊 子）可放入70-75%酒精中，使用时需 火焰灼烧灭菌，冷却后使用。
（4）外植体放入超净工作台内，臵 70-75%酒精中5-60 秒，0.1％氯化汞610分钟，或10%的漂白粉上清液中10-15 分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。灭菌 时需进行搅动。
常用灭菌药剂的使用和效果
三、培养
1、培养含义
指把离体植物材料放在培养室(有光照、温度条件) 里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程。
2、培养方法


(1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材 料的方法。是现在最常用的方法。虽然 该方法设备简单，易行，但养分分布不 均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒 现象发生。 (2)液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养 植物材料的方法。由于液体中氧气含量 较少，所以通常需要通过搅动或振动培 养液的方法以确保氧气的供给，采用往 复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速 度一般为50～100r/min，这种定期浸没 的方法，既能使培养基均一，又能保证 氧气的供给。
灭菌剂 次氯酸钠
次氯酸钙 漂 白 粉 氯 化 汞 酒 溴 精 水
使用浓度（%） 9—10
2 饱和浓度 0.1—1 70—75
清除的难易 易
易 易 较难 易
消毒时间 5—30
5—30 5—30 2—10 0.2—2
效 果 很好
很好 很好 最好 好
过氧化氢 硝 酸 银
抗 菌 素
10—12
1—2
最易
易
5—15
石龙芮下胚轴 培养产生胚状 体过程
体细胞胚状体发生型Ⅱ
器 官
外 植 体
游离单细胞
胚 状
小孢子 愈伤组织
试 管 苗
体
胚状体形成植株的特征：
1.具两极性 2.胚状体的维管组织与外植体的维管 组织无解剖结构上的联系 3.胚状体的维管组织的分布是独立的 “Y”形 4.数量多，速度快，结构完整，成苗 率高
2、供体植株的管理
取自室外的外植体材料，供体植株 的管理十分重要，这与外植体培养时的 污染率密切相关。植株管理中应注意：
⑴避免昆虫危害 许多昆虫如蚜虫、 螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒 介，会引起植物组织的潜在感染。
⑵注意防病 尤其是真菌和细菌病害 的侵染，取自感病植株的外植体，在 培养中的污染率远远高于来自健康植 株的外植体，必要时需使用化学药剂 防治病害。 ⑶控制湿度 给供体植株浇水时应从 根部给水，避免从上部浇水，以免上 部形成易于病原侵染的湿度环境；尽 可能降低温室湿度；取材前尽可能保 持植株干爽。
2—10
好
很好
1
4—50mg/L
较难
中
5—30
30—60
好
较好
3、外植体的接种
（1）材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或 解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成 0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。 微茎尖要剥成只含l—2片幼叶的茎尖大小等。在 接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 （2）解开包口纸，将培养瓶口几乎水平拿着， 避免灰尘落入瓶中。使瓶囗靠近酒精灯火焰，并 将瓶口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。
二、外植体的灭菌与接种
1、预处理 先对植物材料进行修剪整理，去 掉不需要部分，将准备使用的植物材 料（外植体）在流水中冲洗20-60分 钟，备用。如特别不洁的外植体，可 先用加有洗涤剂的水清洗10-15分钟 ，再用流水冲洗干净。
2、表面灭菌 （1）操作人员穿戴灭过菌的工作服、 口罩。进入接种室前双手用洗涤剂清 洗干净，操作前再用70%酒精或消毒 剂擦洗双手。 （2）操作期间双手和台面常用70% 酒精或消毒剂擦拭。超净工作台使用 前必须用紫外灯照射杀菌，然后开启 风机。
外植体成苗途径
根、芽
★
外 植 体
愈伤组织
芽
根
试 管 苗
根
胚状体 原球茎
芽
根、芽
根、芽
类型
方式
事例
丛生芽增殖型 器官发生型 胚状体发生型
原球茎型 球茎芽型 块茎型 鳞茎型 孢子型
腋芽萌发，以芽增殖芽，扩大繁殖系数
甘蔗、香蕉、香石 竹、丝石竹
通过脱分化形成愈伤组织，再分化出苗 烟草、油菜等 从愈伤组织或直接从子叶、下胚轴和花 甘蔗、胡萝卜、石 药培养中产生 刁柏等
光照
1）光强 ★影响外植体细胞的增殖、
组织和器官的分化。一般 培养室的光照强度要求 1000～5000lx。
★愈伤组织的诱导有的在光照下有促进 作用；光照强，幼苗生长健壮；光照弱， 幼苗生长弱小，容易徒长。
2）光质
★不同波长的光对细胞的分裂和器官的 分化有影响。
如：①红光促进杨树愈伤组织的生长， 蓝光阻碍其生长。
（3）壮苗和生根培养
◆壮苗 ◆生根培养基：1／2或1／4MS基本培养基； 不加或少加CTK，适量添加NAA；糖浓度11.5%。 ◆培养条件：增加光强，达3000-10000lx。
◆生根方法与途径 ①新梢基部浸入50或100ppmIBA液4－8h；
②在含IAA类培养基中培养4－6d；
③移入含活性碳的生根培养基培养。
（3）迅速用镊子夹取切割分离下的所需组织、 细胞、器官，送入培养容器内，轻轻插入培养基。 若是叶片直接附在培养基上，以放1—3块为宜。接 完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。然后及时 盖上瓶盖或封口。 注意： 所有操作均应严格保持瓶口在操作区以内， 且不远离酒精灯；工具用后应及时灭菌，避免交 叉污染；工作人员操作时禁止不必要的谈话。