1 WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶 HRP（Horseradish Peroxidase， 属于过氧化物酶 POD 类）和碱性磷酸酶 AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶β-Galactosidase。
Hyperfirm ECL/CCD
虽然延长信号持续时间让研究人员能充分利用成像系统的所有特点，但低极限的灵敏度才是研究者期望的终极目 标。除了拥有王牌产品 ECL 的 GE 公司，化学发光底物方面不得不提到 Pierce 公司。Pierce 形象广告十分有趣鲜明： 用不同色彩的手掌印来表示 Pierce 真的很有一手:）。这家已经有半个世纪历史、在蛋白质化学领域声誉卓著的的公司 6 年前与 HyClone 合并，拥有世界上最优秀的 HRP 化学发光底物生产技术——世界上许多知名的化学发光底物试剂盒 厂商都采用 PIERCE 提供的化学发光底物作为生产原料。其中最耀眼的璀璨之星是 SuperSignal 系列，就像印证上面我 们提到的选择显色系统的标准一样，SuperSignal 灵敏度高（有 10-12g 级，10-14g 级，10-15g 级选择），发光持久（6-24 小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏 6 个月，4℃至少是 12 个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释 倍数是同类产品的 10 倍以上，这对于宝贵一抗来说十分重要）。让人几乎无法从中挑出毛病来，如果说有的话，当然 就是希望便宜一点，再便宜一点罗。另外需要提醒的是抗体一定要比底物显色法中稀释更多倍数，不然过于灵敏（背 景高）可不能怪 Supersignal 哦，还有记得不能拿叠氮钠来当防腐剂――因为叠氮钠会抑制 液要用棕色瓶避光保存。Pierce 的很有一手不仅仅于此，还有更好玩的东西——不用转膜直接在 PAGE 胶上做 Western Blot 的好东西！且看生物通后面慢慢介绍。
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WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 WB 蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实 验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非 常之重要的——各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea 是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把 我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果 WB 产品。 讲完了 Western Blotting 的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下 WB 的检测系统。 一般的 WB 检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。我个人觉得底物显色这最后一 步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等， 酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可， 也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者 Protein A 或 G 等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急， 生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个 WB 高手。另外如果实验室有已经建立的 固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助——这也就达到我们的 目的了。 封闭和一抗的选择没有太多的选择余地——封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用 范围的，说明可以用于 WB 的就 OK。如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过 SDS-PAGE 变 性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。如 果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而 选择范围更大通用性也更强。除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。还听说有用荧光标记的一抗直接检测 而降低背景和非特异结合，不过由于少了二抗的级联放大信号扩增，信号也会比较弱，所以需要选择荧光信号特别明 亮的标记（Invitrogen 收购了著名的 Molecular Probes 后有推出 Alexa Fluor 的抗体标记试剂盒，生物通这里有详细而精 彩的介绍，我们就不罗嗦了。毕竟不是 WB 的主流方法。）一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上 建议的 WB 稀释度附近做 2—3 个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。 二级试剂的作用是信号扩增，选择是根据一抗的标记形式而决定的，对于无标记的一抗，可以选择对应一抗来源 种属的标记二抗，或者更便宜的标记蛋白 A（来自金黄葡萄球菌 Protein A 可以高度亲和来自人，兔，豚鼠的 IgG，但 对大鼠、山羊和鸡的 IgG 亲和力弱）。不过，二抗是更可靠的选择——除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你 准备采用的检测方法选择合适的标记。
. HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于 HRP 比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、 稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP 的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物 2 大 类。对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性——比如底物可溶性高使用就比较方便； 对于 WB 来说产物不可溶有助于信号在原位的积累和结果的稳定（产物可溶的底物更适合于 Elisa）。
Secondary antibody
Up to 1:500 000
Up to 1:15 000
Up to 1:200 000
Blocking Agent included
Yes-ECL Advance Block
Certain systems
Certain systems
Simple reprobing Yes
protocols
Yes
Yes
Emission duration
4-6 h
1-2 h
24-18 h
Recommended membrane
Hybond-P or Hybond ECL
Hybond ECL
Hybond-P
Recommended detection
Hyperfirm ECL/CCD
Fluorescent Scanner/ Hyperfirm ECL/CCD
ECL Plus High sensitivity Western blotting and chemifluorescent detection on scanners Up to 20 times greater than ECL Very Good Up to 1:20 000
3
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底物
DAB
4-CN
AEC
TMB
学名
3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride
4-chloro-1-naphthol
3-amino-9-ethyl carbazol
3,3,5,5 tetramethylbenzidine
分子量
214.14
178.58
210.28
240.4
2 WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
易成像的优点，能获得很好的黑色沉淀成像。用金属离子增强信号的 DBA 显色试剂灵敏度可以高达 20pg。TMB 的 signal-to-noise 信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的 WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景， 因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数；ACE 各方面性质与 DAB 相似，但灵敏度要比 DAB 差一点。
Sensitivity
Up to 10 times greater than ECL Plus
Up to 10-12g
Antibody economy
Outstanding
Good
Primary antibody
Up to 1:100 000
Up to 1:10 000
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ECL Advance
ECL
Recommended applications
Highest sensitivity Western blotting primary antibody and/or target is very low abundance
Routine Western blotting
GE Healthcare（原安玛西亚）的 ECL 堪称是经典，ECL 在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词， 有时竟然是高品质文章的保证之一，可见其经典。后来推出的 ECL Plus 和 ECL Advance 不单将检测灵敏度提高了 10 —20 倍，发光时间也长达 24 小时以上，兼容 CCD 成像系统的检测，使得 ECL 系统继续领导潮流。前不久 GE Healthcare 公司在生物通上发布了 ECL 全系列的 65 折特价优惠，价格相当吸引，对于 ECL 的忠实粉丝们实在不该错过。
酶促反应比同位素安全且快速，已经成为 Western Blot 的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不 同的显色方法：化学发光 Chemiluminescent 和底物显色 Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努 力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到 pg 级别，甚至还有 Femto 级别的，灵敏度超过了