實驗六細菌生長曲線之測定◎ Exp 11. Turbidity of bacteria一、目的：在進行細菌生長曲線之測定前，必須先了解 U-2001 Spectropho-tometer 操作方法，才能將細菌的數量以吸光值的方式表示出來。

二、原理：請詳讀整理 p. 90-92，學會調整 Optical density (O.D.) 【Exp 13.會用到】。

三、器材：1. culture：(每組)24 hr Escherichia coli (broth)2. medium： (每組)Nutrient broth3. equipment ：1 ml pipette，pipette aid，cuvette，拭鏡紙，廢菌液杯，裝蒸餾水的洗瓶，滅菌空試管，U-2001 Spectrophotometer，振盪器。

四、實驗步驟※由助教先示範操作方法，再由學生自行操作與測量待測液之吸光值。

1. 了解 U-2001 Spectrophotometer 操作方法：a. 溫機約 15 分鐘。

b. MENU → (主目錄) 選 1. Photometer →輸入波長 600 nm 及 ABS →Forward →c. Nutrient broth 歸零 autozero → (前、後二支 cuvette) ※1d. 取出後面之 cuvette ，倒入待測液※2，等到右上方數據穩定後，按下 Start →記錄。

※1 cuvette 有石英管 (測波長 340 nm 以下)、玻璃管、塑膠管等材質，本實驗使用塑膠材質之比色管。

※2 每次測定前需先用蒸餾水滴洗cuvette，再以待測液潤濕，倒掉，再裝入待測液，測完倒掉，用蒸餾水滴洗。

測定之前cuvette 須用拭鏡紙擦乾，手握管的非透明處；廢菌液請滴洗入廢菌液杯中，集中處理) 。

2. 每組取一管助教所準備之E. coli當待測液，實際演練U-2001Spectrophotometer 操作，測出其原液 O.D. 【Exp 13. 將會利用到此操作，故須熟悉其操作步驟】。

◎ Exp 12. Serial Dilution-Agar Plate Procedure to Quantitate Viable Cells一、目的：1. 學習連續稀釋法。

2. 觀察活菌數。

二、原理：微生物數目之計數法有：1. 直接顯微鏡計數 (Direct Microscopic Counts)：以Petroff Hauser chamber 計數。

僅計數微量菌液，再由數學方法求取總菌數，此法迅速方便但活與死菌皆涵蓋之且總菌數若低於一百萬時，準確度差。

2. 電子細胞計數器 (Electronic Cell Counters)：如 Coulter Counter，此法不能區分活或死菌，也無法區別惰性顆粒物質與細胞物質。

3. 化學方法 (Chemical Methods)：以間接測定蛋白質濃度、DNA產量、細胞質量及代謝物等反推菌數。

4. 分光光度計分析 (Spectrophotometric Analysis)：利用穿透菌液之光線量，隨菌量增加而減少。

此法迅速但菌數若低於一千萬時，敏感度差。

5. 連續稀釋-洋菜平板法 (Serial Dilution-Agar Plate)：此法乃計數活菌。

利用無菌水對菌液做一連串稀釋，採 Pour Plate 法進行之，經隔夜培養後計數 (或者使用Quebec，參考課本 Figure 21.4, p.89)。

本實驗課中繪製細菌生長曲線之方法便是利用連續稀釋-洋菜平板法，故Exp 12 與細菌生長曲線之測定一併進行。

◎ Exp 13. The Bacterial Growth Curve一、目的：了解細菌的族群生長變動，繪製生長曲線 (growth curve)，並求出增代時間 (generation time)。

二、原理：a. 細胞的生長：將細菌接種在液態培養基中，置於其最適環境下 (最適溫度、pH 及氣體組成) 培養，則可求出一細菌生長曲線。

細菌之生長曲線可分成以下數個時期：1. 遲滯期 (lag phase)：細胞正在適應新環境，數目無明顯增加。

2. 對數期 (log phase)：細胞生長快速，數目呈幾何級數增加。

3. 靜止期 (stationary phase)：因養分耗盡、代謝廢物的堆積，細胞分裂與死亡速度相當，故其數目不增加。

4. 死滅期 (death phase)：細胞快速死亡，數目呈幾何級數下降。

b. 生長曲線之測量：可用 pour plate 法，直接求得活細胞數目，或是用分光光度計讀值法，間接推測細胞生長量。

之後在半對數方格紙上作圖。

c. generation time 的計算：1. 較粗略的計算 (分光光度計結果)： GT ＝ t (O.D. 2n) － t (O.D. n) GT ：generation time2. 直接細胞數目的計算 (pour-plate 之結果)：GT ＝B ：在 log phase 上一點的細胞數目。

b ：在 log phase 上另一點的細胞數目。

t ：B 點與 b 點的間隔時間。

t log 2log b － log B三、器材：1. culture：(每組)12 hr Escherichia coli2. medium：100 ml BHI 1 瓶 (棉花頭三角瓶)99 ml 無菌水 18 瓶 (稀釋牛奶瓶)400 ml NA 1瓶 (放於 50℃ Water Bath 中)3. Equipment：(每組)37℃ shaker incubatorU-2001 spectrophotometerpetri dishes 24 個micropipettes1 ml 與 200µl micropipette tips (滅菌盒中)滅菌空試管 6 支cuvette 1 支安全吸球10 ml sterilized pipettes 6 支計時器(自備)、廢菌液杯、拭鏡紙、裝蒸餾水的洗瓶、振盪培養箱。

四、實驗步驟1. 標示工作：(班別、實驗組別、日期)a. 無菌水：t0，t30，t60，t90，t120，t150 (每個 t 有 3 個稀釋度即 10-2，10-4，10-6故共有 6×3 = 18 瓶)b. petri dishes：每個 t 標示有 10-4，10-5，10-6，10-7故共有 24 個。

2. 流程：(參照 Fig. 21.1)1a. 取 5 ml 的 log phase E. coli culture 到 100 ml BHI broth，測 600 nm 下之 O.D. 值，記錄之並登錄於黑板。

(為t)1b. 取 1a. 0.1 ml 到 9.9 ml 無菌水稀釋瓶中→ t0，10-2。

1c. 取 1b. 0.1 ml 到 9.9 ml 無菌水稀釋瓶中→ t0，10-4。

1d. 取 1c. 0.1 ml 到 9.9 ml 無菌水稀釋瓶中→ t0，10-6。

☆ 1b. ~ 1d. mixing sample 的方法請參考課本 Figure 21.3, p. 89。

△使用安全吸球請小心，玻璃 pipettes 及pipette tips 用完後請分別丟入回收桶中，待下課後一併滅菌清洗或丟棄。

2a. 取 1c. 1 ml 做 pour plate ※1→ t0，10-4。

0.1 ml 做 pour plate → t0，10-5。

2b. 取 1d. 1 ml 做 pour plate → t0，10-6。

0.1 ml 做 pour plate → t0，10-7。

☆完成 2a.的 plate 待凝固倒置培養 37℃，24hr 後記錄菌數並登錄於黑板※2。

3. 當 1a. 已做完 1b. 放入 shaker 120 rpm 37℃，30 分鐘 (為t30)※3。

4. 測 O.D.。

(記錄之並登錄於黑板) ※45. 重覆 1b.~2b.6. 重覆 3.(為t60)7. 其它 t90，t120，t150依此類推。

◆ 100 ml BHI 三角瓶，每一次完成 30 分鐘的培養後，於測 O.D. 前，可先取出 5 ml 於滅菌空管中，三角瓶馬上再放入 shaker incubator 中培養，以節省時間，之後再分別進行測 O.D. 及稀釋工作。

廢液丟在稀釋過不用的牛奶瓶中。

※1 倒 plate 時，培養基量約 2/3 圓面積，倒完馬上蓋蓋子並前後左右各輕搖 3 次，使培養基充滿於 petri dish 底部，但需小心勿將培養基搖出碰到蓋壁。

※2 菌數若為 TNTC 或 TFTC 也請算出約略菌數。

(一個 plate 可接受菌落菌數在 30 - 300 個之間)※3 100 ml BHI 三角瓶的 culture，需於放入 shaker incubator 後才能開始計時。

※4 O.D.若＞ 0.6 請稀釋再測，稀釋倍數需記錄。

(O.D. 值在 0.1~0.6 之間較可信，為在線性範圍內)※5 cuvette 回收。

＊實驗後的觀察注意事項：1. 實驗結果之紀錄法：TNTC (too numerous to count)：每個 plate 菌落數大於 300 個，請畫區域約略算出菌數，登記如下：TNTC (1256)。

TFTC (too few to count)：每個 plate 菌落數小於 30 個，請算出菌數，登記如下：TFTC (12)。

的 10-6每個培養時間點須至少有一個 plate 菌落數在 30-300 內，如 t30稀釋度有 40 個菌落則登記為 40×106，若有二個 plate 菌落數在 30~300 內則須明列出，並於括號內記錄平均值。

2. 每個 plate 上的菌落，不管大小皆算是E. coli。

3. 若 plates 的 colony 數目在 30~300 內則須用麥克筆在背面點算詳細，若超過此範圍才可以畫區域倒推算出約略數目，如此可以知道是否菌數有隨培養時間增長而增加，但登記在結果表中時只須記錄30~300 的 plate 即可。

4. 每毫升菌液有多少菌數算法請參考課本 p. 90 的例子5. plates 算完後，請放到 8A 桌待滅菌。