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二、病毒的分离培养
病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病 毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏 感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种） 或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
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(一）动物接种法
接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。
按病毒侵袭部位不同选择适当的 接种途径。嗜神经病毒接种在小 鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹 病毒接种于家兔角膜。
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三、病毒鉴定
1. 形态学鉴定
细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）
•病毒在细胞内增殖后，可引起细胞的不同变化。 常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或 脱落，这些改变称为细胞病变效应 （cytopathic effect，CPE）。
•CPE出现的时间也是鉴定病 毒的标志之一。
4.接种
鸡胚卵黄囊接种：用5～ 鸡胚羊膜腔接种：用 8天鸡胚，以细长针头由 12～14天鸡胚，将检 鸡卵气室端刺入卵黄囊。 材注入羊膜腔，孵育 孵 育 后 取 获 卵 黄 囊 膜 检 后取羊水检查（图7查（图7-7）。常用于某 8 ） 。 常 用 于 流 感 病 些嗜神经病毒的分离。 毒的初次分离。
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细胞折光性↑，变圆○，局部→全层，死亡脱落， 如：肠道病毒
细胞病变
正常细胞
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于培养单纯疱疹病毒、天
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病毒分离鉴花定 病毒和痘病毒。
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5.剖检及收获
收获前鸡胚应置4℃冰箱过夜，使鸡胚内血液 凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将 气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然 后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切 勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉 素小瓶内，于低温保存。
到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有 明显的自然转动。
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（3）死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、 胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断 胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。 鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和 胚胎的位置待用。
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鸡胚接种的优缺点：
优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可 大、不需特殊设备 。
缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的 病毒。
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(三）细胞培养
细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化 学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至 2～4个细胞团悬液进行培养。
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动物接种的优缺点：
优点：（1）不需要复杂的仪器设备；
（2）技术简单；
（3）易成功
缺点：（1）个体差异大
（2）价格昂贵
（3）数量有限
（4）需要隔离畜舍
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（二）鸡胚接种
1. 鸡卵的选择
一般都选新1
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绒毛尿囊膜接种：用10～
尿囊腔接种 用9～12天 l 2天鸡胚，以无菌手续
鸡胚，将标本接种于尿囊 在蛋壳上开—小窗，然后
腔, 孵育后取尿囊液检查 将材料滴在绒毛尿囊膜上
(图7-9), 常用于培养流 ．孵育后。观察膜上有无
感病毒和腮腺炎病毒等。 斑点病变(图7-10)。常用
病毒材料采集与检验结果的关系
采取标本的时期 检查病毒及其成分
测定抗体
潜伏期及前驱期 刚发病或急性期
较难查见 最多查见
未增多
未增多或增多 不明显
恢复期及康复期
很难查见
明显增多 （常超过4倍）
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一、标本的处理
（一）除菌处理
粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫 升，置4℃过夜。
鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫 升，置4℃作用4小时。
对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠 孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙 醚4℃过夜除菌。
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（二）研磨和稀释
对脑、脊髓等组织标本首先应经研磨器或乳钵中 充分研磨后，加稀释液（pH7.6肉汤或10％脱脂牛 乳生理盐水或0.5％水解乳蛋白Hanks液）制成组 织悬液，然后经2000转／分离心20分钟。必要时 可加抗生素处理（同上）。
根据细胞的类型和培养 细胞代数的不同，可将 其分为两种。
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原代细胞培养 即从机体内取出细胞置试管或瓶内 生长成单层细胞后，立即接种病毒，可用于产生病 毒疫苗.这种原代细胞为二倍体细胞，不能保存和 传代,故而不便用于诊断。常用的有鸡胚、猪肾和 地鼠肾原代细胞。 传代细胞 它是由二倍体细胞或癌细胞突变制成的, 染色体数为非整倍体,细胞随时可以获得,生长迅速, 可无限传代.
组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病 变后，就可取培养液或培养液与细胞培养物 混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻融、 超声波等方法使其释放出来。
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优点：
每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感 性相等；
无个体差异，准确性和重复性好； 可严格执行无菌操作； 细胞培养本身就能显示病毒的生长特征； 应用空斑技术可进行病毒的克隆化。
2. 孵育
孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵 育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％， 孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚 发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
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3. 检卵
鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情 况（二天一次）。
（1）未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 （2）活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见
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细胞培养的方法
静置培养：实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2 温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长 分裂，最后长成单层。
旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生 长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四 周，长成单层。
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病毒的获得