Hank’s液清洗细胞
加入病毒生长液，33－35度培养箱培养
MDCK细胞病毒分离
CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差 异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性 有关 每日观察细胞病变(CPE) 标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA 试验阴性者，继续盲传1～2代后，HA试验 仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴 性，标本可弃去
50ul
50ul
A B C
D
E
F
G H
稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液
病 毒 原 液
1：2
1：128
HA：
32
HA＞128 HA： 4
标本的处理
• 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。 • 将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于 MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接 种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测
程序实时调整）
实验室检测
◆核酸检测
◆病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养
◆胶体金快速检测
荧光PCR结果－阳性样品
荧光PCR结果－阴性样品
荧光PCR结果－可疑样品
病毒分离-MDCK细胞
标本接种MDCK细胞 33－35℃培养 每日观察细胞病变(CPE)
MDCK细胞收获
接种流程
清洗MDCK 细胞 Hank’s液清洗细胞，一般清洗2遍 临床采样标本接种细胞
流 程 图
根据使用的细胞瓶的大小，决定接种 量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临 床标本
暴发疫情标本采集
• （1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体 单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例 及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留 观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联 的死亡病例； • （2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内 出现流感样病例异常增多。
• 每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻 拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当 尽量全部采样）。
33－35度吸附1－2小时 24小时后，观察细胞病变。当细 胞病变为3+或4+时，即75～100% 细胞出现病变时进行收获，收获 之前将细胞冻融1～2次，以提高 收获标本的病毒滴度。即使无细 胞病变也应该于第7天收获 （细胞 病变情况：细胞病变的特征是细 胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细 胞核固缩或破裂，严重时细胞部 分或全部脱落 ）
鸡胚分离方法-标记鸡胚
检视标记鸡胚 ◆ 用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 ◆ 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部 的位臵 ◆ 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育 不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
荧光定量PCR
• 引物和探针
– 稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避 光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）； – 涡旋振荡引物和探针； – 瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
• real-time RT-PCR的试剂
– QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443
荧光定量PCR
• 第一次使用前引物稀释
• 1．引物工作浓度（40μM） • 配制方法：
– （1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 – （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引 物浓度为100μM，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的 量为9.1 nmol ，加水量为10×9.1＝91μl） – （3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。
流感病毒实验室检测技术 及盲样考核结果分析
湖南省疾病预防控制中心
微生物检验科 黄一伟 2013-12-27
流感监测目的
• （一）监测流感活动水平和流行动态；
• （二）及时发现流感病毒变异并作出预警； • （三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测 和推荐提供依据。
流感监测内容
• （一）流感样病例监测
• （二）流感样病例暴发疫情监测
细胞病变图
鸡胚病毒分离
标本准备 检卵 标本接种于9日龄鸡胚 33℃～35℃培养72小时
鸡胚分离方法-试剂准备
1) 9～11日龄鸡胚 2) 照蛋灯 3) 70%～75％酒精 4) 1ml 一次性注射器 5) 鸡蛋开孔器 6) 无菌胶布或蜡 7) 10ml 试管和试管架 8) 10ml 移液管或1ml移液器及无菌吸尖 9) 无菌镊子 10) 无菌眼科剪
– 分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶 和DNA酶) – 正反向引物 (40μM) – 双重标记探针(10μM)
• 反应条件：逆转录50℃ 30min→95 ℃ 2min → （95 ℃ 15s → 55 ℃ 30s*）×45 • 反应体系为25ul • 注：*在55 度这一步骤中要收集荧光信号 （FAM）
• 2．探针工作浓度（10/20μM/） • 配制方法：
– （1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 – （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物 浓度为100μM，可作为储存液。 – （3）将100μM的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20μM，可作为工作浓度。
■
鸡胚分离方法
■
接种病毒方法 单腔接种
◆
盲种
◆双腔接种
灯下接种 开窗接种
鸡胚分离流程（1）
◆将标记好的鸡胚的气室朝上放臵在蛋盘上，通常每个样 本接种3个鸡胚 ◆用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm 窗口 ◆用注射器吸200µl处理过的临床标本，装上16 号针头 ◆从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让 液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚 的看到鸡胚胎的位臵。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前， 用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚 随着针头的拨动而动，即可注射100µl标本。将针头退出至 ½ 寸，将另外100 µl标本 注入鸡胚尿囊腔
鸡胚分离流程（2）
◆用同一注射器和针头将同一标本依上法接种
另外的两枚鸡胚 ◆将针头弃于合适的生物安全装臵中 ◆用消毒过的医用胶布封口 ◆ 33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床采样 标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚 生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非 特异死亡应弃去
实验室生物安全要求
季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ级 实验室进行。
流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有 能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物 安全Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。 用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生 物安全Ⅰ级实验室进行
标本的接收
• 接收标本时必须核对送检表 • 流感监测网络实验室的工作人员接到标本 后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统”
红细胞 适用范围 终 浓 度 （％） 孔底部形 状 孵育时间 细胞对照
鸡 流感和禽流 感病毒 0.5（1%）
火鸡 流感和禽 流感病毒 0.5（1%）
豚鼠 流感病毒
人O型血红 细胞 流感病毒
马 禽流感病毒
U或V型
30min 细胞沉积成 圆点状，倾 斜时细胞向 下流成泪滴 状
U或V型
0.75 （ 1.5% ） 0.75 （ 1.5% ） 0.5（1%） /0.5（1%） /0.5（1%） U型 U型 U型 45min 细胞沉积成 环状 60min 细胞沉积成 环状
30min 45min 细胞沉积 细胞沉积成 成 圆 点 状 ， 环状 倾斜时细 胞向下流 成泪滴状
50ulPBS
100ul病毒液
稀释病毒 加入配制好 的红细胞悬 液 充分混匀， 置室温孵育 30-60分钟 观察记录结 果
50ul
50ul 50ul
50ul 50ul
50ul
50ul
50ul 50ul 50ul
采集标本类型
常规
咽拭子 鼻拭子 痰液
特殊
鼻咽/呼吸道吸取物 鼻洗液 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本
采样液
• 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hank’s液或 MEM； • 标本采集后应立即放入适当的采样液中低 温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250μg/mL ）
鸡胚病毒鉴定
鸡胚收获 HA试验
经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继 续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚 病毒分离为阴性，标本可弃去
病毒鉴定
• 红细胞凝集 • 红细胞凝集抑制试验
病毒鉴定流程
红细胞凝集试验
4个凝集单位配制“回滴”
红细胞凝集抑制试验
测流程
临床标本采集 流感病毒核酸检测阳性 接种MDCK细胞 接种鸡胚
红细胞凝集试验
红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒 寄送国家流感中心
核酸检测
• 核酸提取- QIAamp® Viral RNA Mini Kit • 1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 • 2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚 尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10 ％悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。 • 3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。 • 4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取 630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。 • 5）重复步骤4。 • 6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。 • 7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液， 13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。 • 8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的 AVE液，室温静置1－3分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即 为提取的病毒RNA，立即实验或－20℃以下保存。