表面等离子共振技术（Surface张颖娱 综述Plasmon Resonance SPR）学号 10281036生物物理系摘要 : SPR 是一种物理光学现象，而且 SPR 对金属表面附近的折射率的变化极为敏感，利用这一性 质，将一束平面单色偏振光以一定角度入射到镀有薄层金膜的玻璃表面发生全反射时,若入射光的波向量与 金膜内表面电子的振荡频率匹配,光线即耦合入金膜引发电子共振,即表面等离子共振。

以 SPR 原理设计的 生物传感器近来引起广泛的重视。

关键词 表面等离子共振 生物传感器 薄膜1900 年,由 Wood 发现了光波通过光栅后,光频谱发生了小区域损失,这是关于 SPR 这一电磁场效应的最 早记载。

1941 年,FanoU 发现这种“Wood 异常”是由于等离子波造成的。

1958 年,Turbader 首先对金属薄膜 采用光的全反射激励的方法,观察表面等离子共振现象。

此后,至 60 年代 Otto 以及 1971 年 Kretschmann 分别 发表了里程碑性质的文章,激发了人们应用 SPR 于传感机制的热情,而 Kretschmann 结构也为 SPR 型传感器 奠定了基础。

目前 SPR 被尝试用于测量各种物质的结构、特性及其的相互作用等。

1 SPR 生物传感器的基本原理： （如图 2 所示） 表面等离子振动是金属表面自由电子的一种集团运动,代表了一种表面带电的量子振动。

在激励 SP 的 通常方法中,光入射在金属薄膜上,产生衰减场,衰减场的穿透深度 dp 为：（1） 通常要求金属薄膜小于 60mm,达到衰减场中的 TM(横磁波)极化能量耦合并激发等离子态,耦合的数 量、 等离子体的强度受到了金属两侧材料的影响,如果在金属薄膜一侧加一层待测物质,试样与金属薄膜的耦 联影响了结构的折射率,从而影响了反射光、衰减以及等离子体共振。

所以,可以把 SPR 型传感器看作等离 子体耦联效率的度量计。

基原理如图 2 所示， 其中：上述两个公式分别为沿表面传播的波矢量,其中:λ为入射光波长,εm 为金属介电常数 的实部,εd 为金属外介质的介电常数,np 为透镜的折射率,θ为入射光与表面法线的夹角。

发生共振时,入射 光与法线的临界角为:θ=arcsin[εmεd(εm+εd)εg]1/2(4)显然,共振角受到折射率(或介电常数)的影响,此时,金属膜外侧的衰减场为:E=E(0)exp〔-[-εm2εm+εd]1/2zλ〕(5)可见,当电磁场沿着金属表面传播,其衰减场按指数规律衰减。

根据 MAXWELL 方程,激励 SP 需要满足: (1) 绝缘体的介电常数为正实数; (2) 金属薄膜的介电常数为负; (3) 金属薄膜的介电常数的模大于虚部,因为虚部决定了等离子的衰减速度。

对于表面等离子与外部电磁辐射耦合，目前有三种理论模型： （如图 3 所示） (a) 衍射光栅型; (b) Otto 结构:具有高折射率棱镜和半无限电介质,其间存在狭缝,这种方法在实践中不方便; (c) Kretschmann 结构:用金属薄膜来取代半无限电介质,在某个角度,入射到薄膜上的光波矢量与 表面等离子体波矢量的频率相同,光的能量便能有效的传递给表面等离子体。

Kretschmann 结构实现起来相当方便,从而引起了广泛关注。

目前,大多数的研究都以此为基础;衍射光栅型的研究受到微细加工工艺的限制,研发工作开展的相对较少。

同时，由于表面缺陷会造成表面等离子的锥 形辐射，所以 SPR 共振型传感器对金属薄膜要求较高。

2 SPR 生物传感器的结构：. SPR 型生物传感器主要包括光波导器件、金属薄膜、生物分子膜三个组成部分。

其关键在于金属薄膜 和生物分子膜的沉积。

金属薄膜通常采用银膜，但是对于光纤型的传感则更多的使用金膜。

膜厚度通常为 60－90nm。

生物分子膜的成膜方法包括，金属膜直接吸附法、共价连接法、单分子复合膜技术。

目前又出现了软 光刻新技术（又称为分子印膜技术） ，用于分子水平上构造敏感表面。

基于 SPR 的传感器，其传感机制分析可以分为两个部分： （1） SPR 的电磁场效应分析；（2） 生物大分子相互作用对介电物质的影响。

传感过程如图 1 ：图 1 传感器机理示意 表面等离子共振的生物传感系统与其他光生物传感器系统一样，需要光源、光路、光电耦合器件或光 谱分析设备、反应池、液流控制系统。

光源有 He—Ne 激光器、半导体激光器、发光二极管等。

光电耦合 器件主要有光电二极管、CCD 等。

光路往往采用棱镜组或光纤构造。

3 SPR 的应用生物分子相互作用分析(biomolecular interaction analysis,BIA)正是基于 SPR 这一原理,将探针或 配体固定于传感器芯片镀着的金膜表面,含分析物的液体流过传感片表面,分子间发生特异性结合时可引起 传感片表面折射率的改变,通过检测 SPR 信号改变而监测分子间的相互作用。

在ＳＰＲ-ＢＩＡ的实时监测中,我们可以获悉:(1)特异性—哪些分子发生了相互作用?(2)浓度—存在 多少结合分子?(3)动力学—相互作用的速率、结合和解离的比例是多少?(4)亲和性—相互作用的程度有多 大?(5)协同作用—是否存在任何异构效应?(6)相互作用模式—结合模式与不同样品是否存在对应关系? 3.1 SPR 技术在蛋白质组学中的作用 生物分子相互作用分析质谱质谱(ＢＩＡ-ＭＳ)是ＳＰＲ-ＢＩＡ技术与传统的蛋白鉴定技术ＭＡＬＤＩ -ＴＯＦ-ＭＳ(基质辅助的激光解吸离子化时间飞行质谱)有机结合形成的一种新的研究手段。

ＢＩＡ-ＭＳ 分为两步:第一步,ＳＰＲ检测自身环境中的生物分子;第二步,ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ鉴定结合在ＳＰＲ传 感器表面的分析物。

这种方法综合了ＳＰＲ-ＢＩＡ和ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ两种技术的优势,实现了定量 与定性的结合。

ＢＩＡ-ＭＳ在研究蛋白质复合物组分间相互作用的动力学参数、利用结合位点结构的研究筛选功能性的突变、通过依次结合事件的分析揭示重要的生理分子级联反应机制、研究任何蛋白质间的相互作用等方 面具有广泛的用途,是蛋白质组学中研究的有力工具。

(1)蛋白间相互作用方面的研究:利用ＢＩＡ-ＭＳ可以筛选和鉴定感兴趣的蛋白及与 结合的对象,这是ＢＩＡ-ＭＳ的一个主要应用领域。

例如采用ＢＩＡ与基因标签技术进行蛋白质的鉴定。

实验将表达标签基 因融合入未知基因中,通过标签基因的表达来检测痕量表达的靶蛋白。

靶蛋白的分子量由ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ 在传感器芯片表面直接测定,并经序列资料库的搜寻核实、鉴定。

由此可见,ＢＩＡ-ＭＳ在选择性回收靶蛋 白中具有特异性和极高的敏感性,并能有效区别靶和非靶物质。

另外,利用抗原抗体反应,ＢＩＡ-ＭＳ还可用 于食物中一种或多种细菌毒素的检测。

有研究报道采用ＢＩＡ-ＭＳ技术在牛奶、蘑菇等食品中快速实时检 测出葡萄球菌肠毒素和毒素休克综合征毒素Ｉ。

(2) 蛋白结构与功能关系的分析:ＢＩＡ在实时检测分子间相互作用时可提供动力学信息。

同一蛋白质 中不同氨基酸残基与其他分子相互作用时的动力学改变不同,因此可推测出该蛋白内部存在的不同功能基 团、蛋白在翻译后发生的不同修饰。

例如将脂蛋白 B100 固定于传感器芯片上，依次注入不同的单克隆抗 体， 由于不同的抗体与脂蛋白 B100 相互作用的能力不同， 所以可以精确鉴定脂蛋白 B100 上的不同结构域。

其余的用途可以筛选蛋白的遗传多态性，检测人类遗传突变，并且可以区别正常和突变的靶 DNA。

(3)疾病诊断中的应用：由于ＳＰＲ-ＢＩＡ技术具有实时、免标记和非破坏性检测特性,它在医疗诊断 和新药开发与筛选中具有极大的应用潜力。

例如用ＳＰＲ技术对人体内铁蛋白含量进行实时监测，并且指 导临床治疗。

3.2 生物特异相互作用的动力学、结合位点及浓度分析 生物分子作为分析物可与传感芯片上固相化的特定的配位体进行生物特异性相互作用，例如传感芯片 SA 结合生物素化的配位体可与肽类、蛋白质类及 DNA 等分析物结合。

传感芯片 NTA 通过金属络合捕获 配位体可与组氨酸标记蛋白质类分析物结合。

传感芯片 HPA 的疏水性表面涂以规定使用的脂质体类，造成 亲水性表面与分析物结合。

具体应用如下： 1991 年，Karlsson 等应用自动的 BIA 系统进行了单克隆抗体－抗原相互作用的动力学反应研究，并 且通过数学推导和动力学分析计算出 HIV-1 核心蛋白质 P24 在 3×104～7。

4×105L.mol*S-1范围的解离速率常数。

1992 年，Fagerstam 等应用 BIA 进行了胰岛素样生长因子－1 动力学分析，结合位点及浓度分析。

3.3 免疫特异识别机制的研究 T 细胞对抗原的识别是目前免疫学研究的热点。

T 细胞受体（T cell receptor, TCR）只能识别表达于抗 原呈递细胞表面的由主要组织相容性复合物（MHC）分子呈递的抗原肽段。

1994 年，Corr 等提出了应用 BIA 定性、定量地研究 TCR 和 MHC 分子/抗原肽段之间地相互识别特异性和相互作用的强弱及动态常数。

3.4 在其他研究方面的应用 BIA 可在非纯化条件下测定生物分子之间相互作用的能力，因此对筛选和确定一些孤儿受体的未知配 体是一较为理想的技术，被称为“配体垂钓”的方法显示，应用 BIA 可简便快速地从细胞粗提液或细胞上 清液发现及确定细胞受体配体。

如 Bartley 等应用 BIA 获得 ECK 受体的配体 B61。

对抗体特异性研究可直接从细胞培养液中进行。

BIA Johne 等应用 BIA 进行了单克隆抗体的结合动力学研究。

4 SPR 展望 SPR 仪器系统适用面非常广。

在微生物检测、药物筛选、血液分析、DNA 分析、抗原/抗体分析、 有毒气体检测等方面都有不俗的表现,对于环境污染的控制、医学诊断、食品及药物检测、工业遥感等方面都将是有力的工具。

BIA 则作为生物分子特异相互作用的新技术，在生命科学新领域的研究如药物开发、 细胞信号、蛋白质与 DNA 之间的复制、转录、调控等方面的应用，将有更加广阔的前景。

Reference: 1《基于表面等离子共振的生物传感器的历史、现状与前景》 蔡强 李翔 陈裕泉综述 器国家专业实验室(310027) 2《动态范围可调的波导型 SPR 传感器模型》 金红涛,马万云 (清华大学应用物理系,北京 100084) 浙江大学生物传感3《表面等离子共振技术在蛋白质组学中的应用》孙颖, 张阳德 (中南大学湘雅医院肝胆肠外科研究中心, 湖南长沙 410078) 4《生物特异相互作用分析及其应用进展》 陈执中 复旦大学药学院 （上海 200032）。