四、DNA提取的基本步骤
1、核酸的释放：
破裂细胞
释放核酸（机械法与非机械法）
2、核酸的分离与纯化
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤
4、DNA鉴定：浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定
五、DNA提取试验中常遇到的问题
基因组DNA收率较低或无基因组DNA
样本材料太少 细胞破裂不够充分，DNA释放不完全 离心力偏小 两相分离不完全… …
• 没有严格要求
▪ 常规PCR
基因组提取方法
溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高 硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸 磁珠法：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而 当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目 的。 传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害 身体健康。
样本保存和前处理－血清/血浆
保存 现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。 分离得到的血清/血浆放置-70℃保存。尽量避免样本反复冻融。 样本前处理 1. 冻存的血清/血浆使用前溶解应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。 2. 血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。 3. 只需100-200ul样本，基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。
血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的 标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞 等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床 上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检 测.
三、DNA的收率
样本类型 20mg肝脏组织
100mg豆苗 100l全血 2106培养细胞
基因组DNA收率 8 g 10 g 2 g 10 g
样本保存和前处理－口拭子/漱口水
保存 口拭子：干燥后室温保存 漱口水：4℃保存或离心得到沉淀-20℃或-70℃保存 样本前处理 1. 拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。 2. 有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心 得到沉淀再进行核酸提取。 3. 漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。
样本保存和前处理－非抗凝血
保存 非抗凝血即血凝块。-20℃保存一个月；-70℃长期保存。尽可能保证样本 不经过反复冻融。 样本前处理 1. 冻存的血凝块使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。 2. 血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏 碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。
样本保存和前处理－微量血液/干血点/羊水/胸水
保存 微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存； 干血点：干燥后室温或4℃保存； 羊水： -20或-70℃保存。 样本前处理 1. 微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。 2. 干血点加入缓冲液直接进行提取。 3. 羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。
样本保存和前处理－抗凝血液
保存 柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害 作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。 加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月；－70℃长期保存。 尽可能保证样本不经过反复冻融。 样本前处理 1. 冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。 2. 抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。
DNA提取原则1：DNA片段长度
DNA Length
严格要求片段长度:▪ 构建 ▪ PFGE(脉冲场凝胶电泳)没有严格要求:
▪ PCR ▪ Southern Blots ▪ RFLP
DNA提取原则2：DNA产物纯度
• 严格要求产物uthern杂交 ▪ 荧光定量PCR ▪ SNP Microarray ▪ CGH (比较基因组杂交)
DNA提取前样本采集、预处理和保存：
（一）全血 1.抗凝剂
EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素
-80℃ 4℃ 室温
抗凝剂处理血
肝素 柠檬酸* EDTA*
保存2个月，第10天收率90%
第四天收率90%
第10天提取效 果差
提取效果差
第十天收率85% 第四天收率90%
第十天提取效果差
（二）血浆和血清
DNA提取和制备解读
二、样本来源：
理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都 可以提取DNA
样本选择取决于试验目的 全血是基因组提取最常见的样本
血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体 液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包 括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材 料，其中全血、血浆（血清）标本占分子 诊断的60%以上
血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！
样本保存和前处理－白膜层
保存 全血分离得到的白膜层放置-20℃或-70℃长期保存。尽可能保证样本不经 过反复冻融。 样本前处理 1. 白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解 红细胞后得到的沉淀。 2. 冻存的白膜层使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。 3. 虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液 还是必要的，但用量减半。 4. 采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行 操作。即：1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。
基因组提取流程
溶液法（盐析法） 样本裂解 纯化去蛋白 沉淀核酸 洗涤去盐 溶解DNA沉淀
吸附柱法 样本裂解 加入吸附柱 缓冲液漂洗 DNA洗脱收集
红细胞裂解
哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞 对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式：
采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3倍全血体积加 入进行裂解). 采用细胞裂解液进行裂解（TIANGEN的细胞裂解液CL是按照2.5倍全血 体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为 细胞核沉淀，更方便基因组DNA的提取。
DNA降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶
提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因组DNA盐浓度过高 基因组DNA中乙醇未清除净 基因组DNA中可能存在其他抑制因素
提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护DNA长度
不可忽视的细节
—血液基因组提取
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